白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm) Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm) Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，始载于《神农本草经》，有2000多年的药用历史，为中医临床常用中药之一。白芷性温、味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓之功效，用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、疮疡肿痛、风湿痹痛等症。目前，对白芷的研究，仅仅局限于传统的中药制剂质量控制，工艺优化与药理作用研究，未见有先进的提取分析技术手段应用、深入的药效物质基础探讨、全面的体内代谢过程研究等方面的报道。本课题以先进的样品预处理技术、多维色谱-组合质谱法为研究手段，在建立了白芷现代化的提取、分离、鉴别和制备技术平台的基础上，对白芷的体外质量标准和体内代谢过程进行了深入的研究。首先，采用响应面方法优化了白芷高效的加速溶剂萃取技术，进而结合可靠的高效液相色谱-组合质谱法鉴定出白芷提取液中多种成分。然后，以对大鼠的镇痛作用为表征，探索大孔树脂切割所得白芷不同极性组分的药效作用，并采用高速逆流色谱法规模化制备其活性单体成分。所进行的白芷提取、分离、鉴别和制备研究，为白芷深入的体外化学组和体内代谢组研究提供技术、信息以及物质多方面支持。所以，本课题进一步从三方面开展了白芷的体内和体外研究。一、以白芷最优提取方法和化学指纹谱为基础，结合化学计量学手段和多组分定量方法，建立白芷全面的质量控制手段，为白芷用药安全有效提供保障。二、监测SD大鼠口服白芷总提取物后，其血浆、胆汁和尿液中的原型药物及其代谢产物，以探索白芷活性成分的体内代谢特点，为药效成分的寻找提供支持。三、研究SD大鼠口服白芷总提取物后，七种主要活性成分的药代动力学过程，为临床研究提供参考。探索中药体外物质基础、体内代谢特征，对于阐明中药的药效成分及作用机制具有重大意义。其研究具体内容如下：一、加速溶剂萃取技术结合HPLC-PDA-ESI-ITMSn/TOF-MS建立白芷定性成分谱本章首先比较了五种不同提取方法对白芷主要香豆素类成分的提取效率，结果发现，现代化的加速溶剂萃取技术，不仅在提取效率方面比传统的提取技术高出5倍多，而且表现出极高的重现性。因此选择自动化程度高、提取快速高效的的加速溶剂萃取技术作为白芷的提取方法。进一步对加速溶剂萃取技术的提取条件，包括提取溶剂、提取温度、萃取时间和循环次数进行考察，在单因素实验确定建模范围的基础上进行了响应面优化，得到了最佳提取条件为，乙醇为提取溶剂，提取温度为174℃，萃取13min，共循环2次。在取得白芷提取液中各成分种类和含量最多的基础上，利用HPLC-PDA-ESI-ITMSn/TOF-MS技术手段对白芷中的各成分进行可靠的鉴定，共鉴别出白芷ASE提取液中24个成分，同时揭示出白芷成分中各同分异构体的鉴别规律。本章节的白芷体外提取、鉴定为下一步白芷体外质量控制和体内代谢研究奠定了技术和信息基础。二、制备技术结合镇痛药效实验寻找和制备白芷活性组分白芷主要用于治疗偏头痛和痛经，但其药效物质基础不明确。本章首先对白芷总提取物采用大孔吸附树脂分离切割的方法，得到三种不同极性的白芷化合物组，即白芷大极性化合物组，白芷中极性化合物组和白芷小极性化合物组，同时也分离出异欧前胡素单体。然后利用大鼠福尔马林致痛模型，对理化性质不同的各白芷化合物组进行镇痛效果研究，结果发现白芷中极性化合物组和白芷小极性化合物组表现出良好的镇痛活性，其中，以白芷小极性化合物组镇痛活性显著，且出现镇静效果。最后，在确定了白芷有效化合物组的基础上，采用分析型高速逆流色谱技术快速分离纯化制备出了白芷化合物组中6个活性单体成分，即欧前胡素、珊瑚菜内酯、异欧前胡素、花椒毒酚、水合氧化前胡素、氧化前胡素。基于镇痛药效试验的白芷化合物组多组分单体规模化制备的多维切割-高速逆流色谱制备-高效液相色谱纯度分析技术平台的建立为白芷体外多组分定量分析和体内多组分药代动力学研究提供物质基础。三、白芷定量指纹图谱结合模式识别方法进行白芷多组分质量控制白芷种类繁多，商品白芷通常按产地分为杭白芷、川白芷、禹白芷和祁白芷。不同来源的白芷，其化学成分存在差异，进而造成临床疗效上的优劣。本章采用已确立的加速溶剂萃取技术和高效液相色谱方法，构建了来源于全国不同地区的13批白芷样品的HPLC指纹图谱，并对其进行了质量评估。根据药效实验结果，在切割除去了白芷HPLC指纹图谱中，无药效但可能会对白芷质量评估产生影响的白芷大极性化合物组基础上，分别对指纹图谱数据采用相似度分析、聚类分析和判别分析三种化学计量学分析方法，从不同角度区分出两组不同品质的白芷样品，同时找到其HPLC指纹图谱中对白芷质量产生重要影响的共有峰和区分峰，以此作为定量指标。随后，对13批白芷样品中的9个定量指标进行了多组分含量测定，全面评价出白芷样品的质量。经典的中药指纹图谱方法结合模式识别技术可全局化的评价中药质量，同时也为中药定量指标的选择提供依据；中药多组分定量分析能够更详尽的检测到中药中各成分的含量。此外，通过多组分定量分析得到的数据发现，聚类分析由于以较全面的色谱峰数据为基础，相比于相似度分析而言，分类结果更准确。四、SD大鼠口服白芷总提取物后体内代谢指纹谱研究中药体内原型药物和代谢产物分析是研究其活性作用机制的重要环节。本章对SD大鼠口服给药白芷总提取物后的血浆、胆汁、尿液和脑组织样品进行分析。通过比较，选择了两种不同的生物样品预处理技术，液液萃取（liquid liquid extraction，LLE）和固相萃取（solid phase extraction，SPE），对生物样品中的白芷原型药物和代谢产物进行前处理。之后，采用HPLC-PDA-ESI-ITMSn技术进行检测。结果发现在大鼠的血浆、胆汁、尿液和脑组织样品中可以检测到白当归脑、花椒毒酚、水合氧化前胡素、阿坝当归素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、异氧化前胡素、5-甲氧基-8-羟基补骨脂素、欧前胡素、珊瑚菜内酯、异欧前胡素等12种原型药物，并初步鉴定出了13种代谢产物。其中，以尿液中检测到的白芷原型成分和代谢产物的种类和含量最多，可初步推断，白芷中各成分多以原型或代谢产物的形式经尿液排出。五、SD大鼠口服白芷总提取物后多组分药代动力学研究本章针对能够在SD大鼠体内检测到的白芷原型成分，对其中的七种主要香豆素类化合物，即花椒毒酚、水合氧化前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、珊瑚菜内酯和异欧前胡素进行了血药浓度检测，分析出SD大鼠口服给药白芷总提取物后的体内七组分药代动力学特征。采用乙酸酸化-液液萃取的前处理方法，结合高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法，通过五个选择离子通道，在11min内，同时对SD大鼠不同时间点血浆中的7个主要活性香豆素成分进行了定量检测，建立血药浓度-药时曲线，并计算出相关药代动力学参数。结果发现，白芷中的主要活性香豆素类成分多在2h左右达峰，12h内消除完全，所得到的药动学参数为白芷临床给药方案提供依据。本课题利用现代技术手段，基于药效试验，建立了白芷药材中主要活性香豆素成分的高效提取鉴定、快速分离制备、全面质量控制及其多方位体内代谢过程的研究技术平台，并初步揭示了白芷镇痛作用机制的药效物质基础以及体内代谢指纹谱-镇痛效应相关性的科学意义。