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研究背景对于各种原因引起的终末期肝病,目前肝移植仍是唯一确切有效的治疗方法。但是肝源的缺乏、高昂的手术和术后治疗费用以及各种术后并发症限制了肝移植的广泛开展。而肝脏干细胞移植为终末期肝病的治疗提供了新的途径,其中骨髓间充质干细胞(Bone marrow mensenchymal stem cells, BMSCs)因其易分离扩增、增殖分化潜能强、可自体取材等优点,目前受到科研和临床上的广泛关注。但是移植BMSCs治疗肝脏疾病仍存在诸多争议：(1)如何通过简便易行的分离培养方法获得活力好、纯度高的BMSCs; (2)大多数终末期肝病均伴随不同程度的门静脉高压,在门静脉高压这一特殊的血流动力学状态下,移植的BMSCs能否顺利迁移并定植于肝脏；(3)影响BMSCs向肝内迁移定植的因子有哪些；(4)除分化为肝系细胞并替代其功能外,BMSCs会对肝细胞的存活和功能状态产生何种影响。研究目的1.探讨体外分离、培养、纯化BMSCs的可行性,观察体外诱导的BMSCs能否向肝系细胞分化。2.比较经脾移植的BMSCs在正常大鼠和门静脉高压大鼠肝内的分布情况。3.初步探讨影响BMSCs向肝脏迁移定植的因素。4.评估在体外不同共培养条件下BMSCs对肝细胞存活和功能的影响。研究方法1.Sprague-Dawley (SD)大鼠全骨髓细胞差速贴壁培养法分离、纯化、扩增BMSCs,光镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞术检测第5代BMSCs表面CD29、CD90及CD34的阳性率。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)和成纤维细胞生长因子-4 (Fibroblast growth factor-4, FGF-4)联合诱导第5代BMSCs向肝系细胞分化,光镜及电镜下观察分化细胞微观结构及超微结构的变化,免疫荧光法检测分化细胞甲胎蛋白(Alpha fetal protein, AFP)、细胞角蛋白18 (Cytokeratin18, CK-18)和白蛋白(Albumin, ALB)的表达情况。2.受体大鼠随机分为实验组和对照组。实验组大鼠行胆总管结扎术,对照组大鼠实施假手术,术后饲养2周,经脾移植CM-Dil荧光标记的BMSCs分化细胞悬液,继续饲养1周后,测定大鼠门静脉压力同时检测肝功能。取肝组织制作石蜡切片,荧光显微镜下观察肝组织内移植细胞的分布情况并拍照,应用图像分析软件计算各视野红色荧光的积分光密度值(Integral optical density, IOD),并分析其与门静脉压力关系。3.取实验组(胆总管结扎2周)和对照组大鼠肝脏组织,运用大鼠的全基因组表达谱芯片技术对实验组大鼠和对照组大鼠肝脏的基因表达情况进行比较。芯片筛查出差异表达的基因,结合文献报道和美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站提供的Genebank中的基因功能,筛选可能与BMSCs迁移及粘附定植相关的基因。通过Real-time PCR和Western Blot技术在RNA和蛋白水平进行验证。初步筛选出可能与BMSCs向肝脏迁移定植相关的因子。4.灌注并消化人肝脏组织碎片,分离获得游离肝细胞,分别将肝细胞体外独立培养(Mono-culture, Mono组)、与常氧预处理的BMSCs司接共培养(Indirect co-culture with Normoxia preconditioned BMSCs, I-N组)、与缺氧预处理的BMSCs间接共培养(Indirect co-culture with Hypoxia preconditioned BMSCs, I-H组),与常氧预处理的BMSCs直接共培养(Direct co-culture with Normoxia preconditioned BMSCs, D-N组)、与缺氧预处理的BMSCs直接共培养(Direct co-culture with Hypoxia preconditioned BMSCs, D-H组)。共培养第1、4、7天MTT法检测肝细胞的存活情况,同时测定上清液中ALB的含量评估肝细胞功能。结果1.全骨髓细胞培养24小时后可见BMSCs贴壁生长并逐渐分裂增殖。随着连续传代,BMSCs纯度逐渐提高。细胞形态由原代细胞的不规则形或多边形逐渐转变为均一的纺锤形。流式细胞仪检测第5代BMSCs CD29和CD90阳性率均达96%以上。第5代BMSCs经HGF、FGF-4联合诱导2周后AFP、CK18和ALB表达均呈阳性。光学显微镜下显示经HGF、FGF-4诱导的第5代BMSCs逐渐趋于立方形,呈网格状镶嵌排列。电子显微镜显示未经诱导的第1代和第5代BMSCs内细胞器种类及数量无明显差别,而经过诱导的第5代BMSCs分化细胞内高尔基体、内质网、核糖体、线粒体等细胞器均明显增多。2. CM-Dil标记BMSCs的分化细胞后可使细胞膜呈现红色荧光,标记率高达95.5%。CM-Dil对细胞贴壁、生长及增殖无明显影响。胆总管结扎的大鼠饲养2周后,逐渐出现梗阻性黄疸、白陶土样便、深黄色尿。饲养3周后检测肝功能显示实验组总胆红素(Total bilirubin, TB)、直接胆红素(Direct bilirubin, DB)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransaminase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)均较对照组明显升高(TB:121.9±19.2 vs.8.7±4.2mmol/1; DB:116.9.9±19.4 vs.4.9±2.3mmol/1; ALT:105.9±72.7 vs.21.9±6.9u/1; AST: 398.0±209.6 vs.22.1■9.0u/1, P<0.01),血清ALB较对照组明显降低(22.4±6.9vs. 32.2±3.7g/l, P<0.05)。实验组大鼠肝门部均形成0.5-lcm囊肿,肝脏明显肿大变硬,表面布满细小结节。实验组大鼠门静脉压力明显高于对照组(18.04±2.35vs.9.75±1.40cmH20,P<0.0;),提示形成了梗阻性黄疸伴门脉高压的动物模型。肝脏病理红色荧光IOD值实验组明显高于对照组(1130067±209464 vs. 293505±88383/Hpf, P<0.01)。3.经全基因组表达谱芯片筛查,与细胞迁移相关的四个基因CX3CL1、 CXCR4、MLLT4和PDGFA在实验组肝脏组织中表达明显上调。Real-time PCR检测两组肝脏组织中CX3 CL1、CXCR4、MLLT4和PDGFA在RNA水平的表达,结果发现,实验组肝脏组织中CX3CL1 (2-△△C=6.08)和CXCR4 (2-△△C=2.00)表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),而MLLT4 (2-△△C=1.15)和PDGFA (2-△△C=1.32)表达略高于对照组,但差异无统计学意义(P> 0.05)。Western blot检测蛋白质表达发现,实验组CX3CL1 (0.64±0.08 vs.0.32±0.09)和CXCR4 (0.63±0.15 vs.0.40±0.09)蛋白相对表达量明显高于对照组(P<0.05)。4.I-N组和D-N组肝细胞存活率在共培养第4天和第7天均明显高于Mono组(P<0.05)。I-N组与D-N组比较、I-H组与D-H组比较,肝细胞存活率在共培养第l、4、7天均无差异(P>0.05)。I-H组和D-H组肝细胞存活率在共培养第4天分别明显高于I-N组和D-N组(P<0.05),而在第1天和第7天无差异(P>0.05)。共培养第1、4、7天培养液中ALB含量,I-N组与Mono组比较均无差异(P>0.05),D-N组仅在共培养第4天高于Mono组(P<0.05)。D-N组ALB含量在共培养第4天高于I-N组(P<0.05),而D-H组在共培养第4、7天高于I-H组(P<0.05)。I-N组和I-H组、D-N组和D-H组比较在共培养第l、4、7天ALB含量均无差异(P>0.05)。结论1.全骨髓细胞差速贴壁培养法可成功分离BMSCs,通过连续传代可获得纯化。HGF和FGF-4可联合诱导BMSCs分化为AFP、CK-18和ALB表达阳性的肝系细胞。经诱导的BMSCs分化细胞微观结构和超微结构都发生明显改变。2. CM-Dil是细胞移植较为理想的标记示踪材料。SD大鼠胆总管结扎2周后可出现明显的黄疸症状,3周后形成典型的梗阻性黄疸伴门静脉高压的动物模型。胆汁性肝硬化致门静脉压力增高时,经脾移植的BMSCs向肝内迁移增多,提示可能存在某些化学性因子趋化移植的细胞进入病变肝脏定植。3.实验组肝脏组织中CX3CL1和CXCR4在RNA水平和蛋白水平的表达均高于对照组,提示CX3CL1和CXCR4可能参与BMSCs向肝脏的迁移。4.直接共培养和间接共培养均能显著提高肝细胞的存活率,两种共培养方法对肝细胞存活率的影响无明显差别,而经缺氧预处理的BMSCs较常氧预处理的BMSCs效果更为明显。直接共培养能明显提高ALB分泌功能,而间接共培养对肝细胞的ALB分泌功能无影响,BMSCs是否经缺氧预处理对肝细胞ALB分泌功能的影响无差别。