前言 人类妊娠过程中，胚胎植入蜕膜化的子宫黏膜壁并形成胎盘。来自胎盘的滋养层细胞侵袭入子宫粘膜，并打通子宫动脉从而保障胎儿发育中丰富的血运。植入期的子宫内膜呈现抵抗半异基因胚泡的界面，细胞群体发生变化并保持协调的相互作用。细胞相互作用的另一结果是子宫内膜为植入准备而分化，其重要的变化之一是在蜕膜化的过程中，通常发生子宫NK细胞(uterinenaturekiller，uNK)的浸润，发生妊娠时其数目继续增加并与滋养层细胞发生联系。目前植入免疫学(implantationimmunology)研究的热点均聚焦于uNK细胞。从胚泡植入子宫起，子宫内膜的淋巴细胞即重新组合，蜕膜细胞中聚集了大量的淋巴细胞约占40％以上，其中uNK细胞占了早期妊娠蜕膜中内膜淋巴细胞的70％以上[1]。虽然，到目前为止uNK细胞在妊娠中的确切作用仍然是个谜，但对胚胎植入区的研究发现有大量的uNK细胞并与入侵的绒毛外滋养细胞形成紧密接触，提示uNK细胞在调控母体对半异基因胚泡的容受性中起重要的作用。uNK细胞缺陷小鼠胚胎丢失率高达64％、且无子宫内膜腺、胎盘尺寸减少、母体供胎盘血运的大血管畸形[2]，这些现象在植入NK细胞后消失，表明uNK细胞在胚胎植入和妊娠维持中起重要的作用[3]。 近年来，随着胚胎种植机理研究的进展，人们认识到发育到一定程度的胚胎只有种植在具有最大容受性的内膜才能进一步生长。对内膜种植窗的组化研究发现，其典型的内膜容受性标志蛋白分子为avβ3，因此其配体骨桥蛋白(OPN)在生殖中的作用引起极大关注。OPN是一种分泌型糖基化磷蛋白，是重要细胞外基质结构组分，分胞内型和胞外型，胞内型使细胞自身迁移活动加强，胞外型可作为趋化因子诱导细胞迁移，因此OPN参与细胞的黏附、迁移等多种细胞行为的调节，是机体组织或器官发育过程中一个重要的调节因素。目前在生殖领域的研究发现：OPN在多种动物例如山羊、狒狒、猪和老鼠的子宫内膜和蜕膜中的表达[4]；Andera.S[5]等学者曾通过对OPN等位基因缺失和正常鼠的对比研究发现，OPN等位基因缺失鼠胚胎体积均小于对照组，即宫内发育迟缓。这些发现都提示了OPN在胚胎的种植和胎盘形成中起重要的作用，并且可能参与子宫内膜容受性的建立。但目前的相关研究报道不多且大多局限于动物实验研究，而人类与动物的胚胎植入方式又存在着明显的差异。所以本研究旨在讨论OPN在人妊娠早期的母胎界面的表达，及其孕激素对其调控影响。本研究首次初步阐述了OPN在人类妊娠早期母胎界面微环境中的生物学意义，该研究也将为病理性妊娠发病机制及防治的研究提供新的思路和途径。 第一部分 人妊娠早期母胎界面中OPN的表达研究 目的 探讨人早期妊娠母胎界面组织中OPN的表达及生物学意义，旨在为揭示子宫NK细胞选择性聚集及胚胎植入的调控机制提供新的线索。 方法 1.①选择9例孕6～9周的正常妊娠妇女，分离其新鲜蜕膜组织，分离蜕膜淋巴细胞及外周血PBMC；②免疫磁珠法分离纯化妊娠早期子宫NK细胞及外周血NK细胞；③流式细胞仪检测分离NK细胞的纯度；④Trizol法分别提取总RNA；⑤采用RT-PCR技术检测OPNmRNA在人妊娠早期子宫NK(uterine，uNK)细胞和外周血NK(peripheral，pNK)细胞中的表达分布。 2.①选择孕6～9周9例正常妊娠者的标本，分离其新鲜蜕膜组织、绒毛组织；②Trizol法分别提取各组织中总RNA；③采用RT-PCR技术及光密度半定量分析OPN在正常人类早期妊娠流产标本中mRNA表达；④免疫组化技术检测OPN在正常人类早期妊娠流产标本中蛋白水平的表达。 结果 1.人早期妊娠uNK细胞OPNmRNA的表达：人早期妊娠uNK及外周血pNK细胞中均检测到OPNmRNA的表达，光密度值半定量分析(OPN/β-actin)显示：uNK0.78±0.27、pNK0.21±0.19，uNK与pNK细胞中OPN转录水平的表达差异显著(P＜0.05)。 2.正常早期母胎界面中的OPN表达：在9例早期正常妊娠流产标本中，蜕膜组织及绒毛组织都有OPNmRNA水平的表达。免疫组化显示OPN在全部标本的子宫蜕膜组织中腺上皮细胞强表达、蜕膜基质细胞表达；绒毛组织中的细胞滋养层细胞强表达，而合体滋养细胞表达阴性。 结论 1.本研究首次发现了uNK细胞表达OPN分子，其与pNK细胞中OPN表达有显著性差异，提示OPN在妊娠早期uNK细胞选择性聚集和正常妊娠的维持中可能起重要作用。 2.本研究系统观察了OPN在人妊娠早期母胎界面的表达分布，妊娠早期6-9周绒毛、蜕膜组织中OPN呈强阳性表达，合体滋养细胞表达阴性。本结果提示OPN可能与正常妊娠胚胎植入密切相关。 第二部分 孕酮对人妊娠早期蜕膜基质细胞OPN的表达调节作用 目的 观察人妊娠早期蜕膜基质细胞中OPN表达及孕酮对其表达的调节 方法 ①采用酶消化法对蜕膜基质细胞进行原代及传代培养；②不同浓度的孕酮(0，10-7，5×10-7,10-6mol/1)刺激传代培养的蜕膜基质细胞96h；③采用RT-PCR技术检测在不同浓度孕酮作用下蜕膜基质细胞中OPNmRNA表达变化；④ELISA检测不同浓度孕酮作用下蜕膜基质细胞上清中OPN蛋白浓度变化。⑤免疫组织化学方法检测同浓度孕酮作用下蜕膜基质细胞OPN蛋白表达变化。 结果 1.人类蜕膜基质细胞的体外培养体系的建立：采用酶消化法得到人体蜕膜基质细胞悬浮时呈典型的卵圆形，单层培养时为纤维母细胞状。接种后30分钟开始贴壁，逐渐伸长成为纤维母细胞状，呈较长的梭形和不规则星形，核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰有丰富的胞质颗粒。24小时后细胞大多贴壁，6-7天可贴壁汇合。传代后的蜕膜细胞生长迅速，2-3天即可铺满瓶底，镜下细胞形态均一，呈梭形或不规则星形。传三代后其形态无明显变化，而传代培养极性渐不明显。波形蛋白免疫组化显示体外培养传代后的细胞95％以上为蜕膜基质细胞。 2.孕酮对蜕膜基质细胞中OPN的表达： (1)光密度值半定量分析(OPN/β-actin)显示：对照组0.15±0.09、低剂量组0.48±0.21、中剂量组0.83±0.16、高剂量组1.21±0.35。不同浓度孕酮作用下蜕膜基质细胞中OPNmRNA水平随着孕酮浓度的增加而升高，与未加入孕酮的对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)。 (2)ELISA检测对照组、低、中、高剂量组中培养上清中OPN蛋白的含量分别为4.26±2.23、13.34±3.6、28.02±2.88、47.8±4.87ng/ml，培养上清中OPN的蛋白水平随着孕酮浓度增加而升高，与未加入孕酮的对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)。 (3)免疫组化检测对照组、低、中、高剂量组蜕膜基质细胞中OPN蛋白，Image-ProPlus5.0分析总光密度分别为59.66±6.23、80.61±7.51、99.38±5.52、126.23±6.41，与未加入孕酮的对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)，且孕酮对蜕膜基质细胞中OPN蛋白表达成剂量依赖性。 结论 妊娠早期蜕膜基质细胞表达OPN，其表达强度受孕酮的调控，呈现剂量依赖增强。此研究结果提示，OPN可能是参与妊娠早期子宫内膜蜕膜化的主要细胞因子，对正常胚胎植入的调控可能起重要的调节作用。