本研究实验材料为强耐寒性植物新疆沙冬青,对编码耐寒相关蛋白酶的AnGPAT基因进行分子克隆及序列分析,构建了转入AnGPAT基因的大肠杆菌原核表达载体、毕赤酵母真核表达载体并进行体外表达分析及蛋白纯化,并且通过构建转AnGPAT基因烟草对基因功能进行验证。为发掘新的耐寒优势基因及基因工程在林木育种上的应用提供了参考。本课题主要研究结果如下：1.PCR扩增获得新疆沙冬青GPAT基因的cDNA全长序列,命名为AnGPAT。新AnGPAT基因编码区序列长1380bp,编码460个氨基酸残基,预测蛋白分子量40.9kD,等电点7.38。自95至171位氨基酸为GPAT_N保守功能域,201到436位氨基酸残基为LPLATs保守功能域。进化分析表明AnGPAT与野大豆(Glycine soja)GPAT同源性最高,达83%。2.将AnGPAT基因编码区与表达载体PET-30a(+)连接,构建大肠杆菌诱导型表达载体PET30a-AnGPAT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并纯化后,获得40KDa左右重组AnGPAT蛋白；将AnGPAT基因编码区与表达载体pPIC9连接,构建毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-AnGPAT,转化到毕赤酵母GS115中,诱导表达并纯化后,获得40KDa左右重组AnGPAT蛋白。3.对转AnGPAT基因大肠杆菌BL21进行总脂肪酸含量的测定,结果表明其不饱和脂肪酸含量高于对照,证明原核表达的AnGPAT具有生物酶活性。4.将AnGPAT基因编码区与表达载体PBI121连接,构建真核表达载体PBI121-AnGPAT,导入农杆菌LBA4404,农杆菌介导烟草愈伤组织,获得转AnGPAT基因烟草,并对转基因烟草的进行PCR扩增,证明了AnGPAT基因已经整合到转基因烟草的基因组中。