雌激素在乳腺癌发生发展中起重要作用。雌激素G蛋白偶联受体（estrogen（G-protein coupled）receptor，GPER）是第三种独立的雌激素受体（estrogen receptor，ER），通过调节细胞内第二信使及反式激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）相关信号通路介导雌激素效应，引起细胞伸展、增殖和迁移等生物学行为改变。研究发现GPER在乳腺癌中广泛表达且影响肿瘤增殖、迁移、侵袭及转移，在雌激素引起的肿瘤进展中扮演重要角色。内分泌治疗药物他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是GPER激动剂，可激活GPER影响乳腺癌细胞生物学行为。因此，GPER在乳腺癌TAM耐受中起关键作用。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAF）是肿瘤细胞周围一种处于持续激活状态的成纤维细胞，通过分泌生长因子、蛋白酶及雌激素等产物，以旁分泌的方式广泛影响癌细胞的增殖、侵袭、转移等行为，是肿瘤微环境的主要成分之一。前期研究提示GPER可能在CAF及类似间充质来源细胞中产生一定影响。本研究拟探讨GPER在乳腺癌CAF中的介导的雌激素效应及其在肿瘤TAM耐受中的可能作用，分以下5部分：1. GPER在乳腺癌间质成纤维细胞和肿瘤实质中的表达与意义目的：探讨GPER在原发性乳腺癌组织肿瘤间质成纤维细胞（tumorstromal fibroblast，TSF）及肿瘤实质中的表达与意义。方法：采用免疫组化法检测141例石蜡包埋原发性乳腺浸润性导管癌标本中GPER的表达，分TSF和癌细胞二部分与肿瘤临床病理变量进行关联分析。结果：GPER表达于乳腺癌TSF和癌细胞胞浆，血管平滑肌和内皮细胞细胞也可见GPER阳性染色。41.8%（59/141）的肿瘤可见TSF表达GPER，其在TSF的表达与年龄、肿瘤大小、淋巴结病理分级、临床病理分期、组织学分级、预后指数及ERα、孕激素受体（progesteronereceptor，PR）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factorreceptor-2，Her-2）表达无显著相关性。在ERα+和ERα-乳腺癌中，GPER在TSF表达的肿瘤比例分别为40.5%（32/79）和43.5%（27/62）。66.7%（94/141）的肿瘤可见GPER在肿瘤实质中表达。GPER在TSF和癌细胞的表达显著相关（P<0.001）。GPER和ERα在癌实质共同表达的比例达41.1%（57/141），这两种ER在癌细胞的表达显著相关（P=0.041）。58.1%（36/62）的ERα-肿瘤可见癌实质表达GPER。GPER在癌细胞中的表达与上述其他临床病理变量无显著相关性。结论：GPER在41.8%的乳腺癌样本中表达于TSF，在66.7%的乳腺癌组织中表达于肿瘤实质，在ERα+和ERα-的乳腺癌中都可能在CAF和乳腺癌细胞中介导雌激素作用，影响肿瘤生物学行为。2.乳腺癌CAF的分离、培养、鉴定与永生化目的：从乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织分离成纤维细胞并进行原代培养，鉴定其CAF性质后进行永生化，为后续实验提供材料。方法：采用胶原酶消化法从16例乳腺癌组织及部分癌旁组织分离成纤维细胞并进行原代培养，通过免疫荧光检测CAF蛋白标记的表达，应用xCELLigence活细胞分析系统检测细胞增殖及迁移能力，通过脂质体将人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）逆转录病毒真核细胞载体转染至PT67细胞进行包装并感染CAF构建永生化细胞。结果：从乳腺组织分离的成纤维细胞贴壁生长，多呈纺锤形，细胞较大，细胞内可见较多纤维丝样结构。从癌组织分离的成纤维细胞同时表达α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP），阳性率超过90%；从癌旁组织分离的正常成纤维细胞（normal fibroblast，NF）则很少表达α-SMA和FAP。CAF较NF具有更强的细胞增殖（P<0.001）和迁移能力（P<0.001）。成功构建2株永生化CAF，可连续传代，细胞明显变小，仍呈纺锤形且表达α-SMA。结论：应用胶原酶消化法可成功分离成纤维细胞，从乳腺癌组织分离的成纤维细胞具有CAF特征，经永生化后未显著改变CAF基本特性，可用于后续试验研究。3. CAF中GPER的表达与受体活性鉴定目的：明确乳腺癌CAF的ER表型及GPER的受体活性。方法：采用逆转录聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、实时荧光定量PCR及免疫荧光技术检测原代CAF、永生化CAF、NF及乳腺癌MCF-7细胞（阳性对照）中GPER、ERα和ERβ在信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）和蛋白水平的表达。用17-β-雌二醇（17-β-estradiol，E2）及GPER特异性激动剂G1刺激细胞，激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光探针标记的钙离子（calcium，Ca2+）浓度改变，Western blotting检测细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulated kinase，ERK）磷酸化水平，xCELLigence活细胞分析系统观察验证GPER作为G蛋白偶联受体的激活。结果：CAF及永生化的CAF（CAF-hTERT）均表达GPERmRNA，表达量为MCF-7细胞的0.2~1.01倍，但很少表达ERα和ERβ。NF中也检测到GPERmRNA。CAF及CAF-hTERT表达GPER蛋白，但不表达ERα和ERβ。NF也表达GPER。不同浓度的E2及G1可刺激CAF细胞内Ca2+浓度在1~2min内迅速升高，在5~30min内引起ERK磷酸化水平明显提高，细胞指数在1小时左右一过性增高；用GPER特异性拮抗剂G15可抑制上述改变。E2、G1在NF中则未刺激出明显反应。结论：CAF及NF表达GPER，CAF不表达ERα和ERβ。GPER在CAF中介导雌激素的非基因性快速反应，具有受体活性。在NF中，GPER则不能被激活，没有受体活性。4. GPER在CAF中介导的雌激素影响与机制目的：探讨GPER在乳腺癌CAF中介导的雌激素影响与机制。方法：采用CCK8试剂盒检测细胞生长活性，xCELLigence活细胞分析系统观察细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期；结合GPER特异性抑制剂G15、EGFR抑制剂AG1478、ERK抑制剂U0126及磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抑制剂Wortmannin处理明确GPER对细胞生长和增殖的影响与机制。采用xCELLigence系统、形态学比较及Transwell实验分别观察E2、G1对CAF细胞贴壁、伸展和迁移的影响。结果：加入E2、G1培养可促进细胞生长，10-8M的E2和10-6M的G1为最佳浓度，培养72h可使CAF细胞数达到对照组的162.8%±12.1%（P=0.0018）和155.9%±9.9%（P=0.0019）；xCELLigence监测观察发现E2（10-8M，下同）和G1（10-6M，下同）明显促进细胞增殖（与对照相比，P<0.001），药物处理96h后对照组、E2组和G1组标准化细胞指数分别达到2.585±0.186、4.212±0.361和3.794±0.312；E2和G1处理细胞可使S期细胞比例明显增加（26.86%±5.64%和24.70%±6.22%vs.13.38%±3.28%，P=0.023，0.041），G15（10-6M，下同）、AG1478（10-5M，下同）及U0126（10-5M，下同）预处理可显著抑制上述变化（P<0.05），但Wortmannin（10-5M，下同）预处理则无显著影响（P>0.05）。E2和G1处理细胞后，xCELLigence系统观察到处理组首个细胞指数峰（反应细胞贴壁、粘附）提前约3小时出现，且峰值较对照组明显增大（E2组第5.97h达峰值2.272±0.059；G1组第6.22h达峰值2.257±0.223；对照组第9.15h达峰值1.982±0.059，P=0.0004，0.036）。加入E2、G1分别培养12和24h后，光镜观察发现细胞形态更饱满、伸展，Transwell实验提示迁移细胞明显增加（E2组132.1±30.3个，G1组108.8±19.8个，对照组34.5±6.3个, P=0.006，0.004），G15预处理可显著抑制E2和G1的伸展和迁移促进作用。结论：E2可通过激活GPER-EGFR-ERK通路促进CAF生长和增殖。GPER激活还促进CAF粘附、伸展及迁移。GPER可能通过CAF参与肿瘤进展，靶向抑制GPER理应是乳腺癌内分泌治疗的发展方向。5. CAF中GPER在肿瘤他莫昔芬耐受中的作用探讨目的：探讨TAM通过GPER对CAF的影响及乳腺癌CAF中GPER在肿瘤TAM耐受中的可能作用。方法：通过激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+浓度，Westernblotting检测ERK磷酸化水平，xCELLigence活细胞分析系统验证GPER的激活，明确TAM对GPER的激活作用。采用CCK8试剂盒检测细胞生长、流式细胞仪检测细胞周期，结合G15、AG1478、U0126及Wortmannin处理明确TAM对细胞生长和增殖的影响与机制；采用形态学比较及Transwell实验观察TAM对CAF细胞伸展和迁移的影响。加入雌激素合成底物睾酮，化学发光法检测培养基中E2的浓度，结合TAM、G1、G15、AG1478等处理明确TAM通过GPER对CAF合成E2的影响；实时荧光定量PCR检测芳香化酶基因CYP19A1在mRNA水平的表达。结果：不同浓度TAM刺激使CAF中Ca2+浓度、ERK磷酸化水平升高，xCELLigence系统监测明确其可激活GPER。与E2及G1类似，TAM（10-8M，下同）可激活GPER-EGFR-ERK通路促进细胞生长和增殖。TAM也可通过激活GPER促进细胞伸展和迁移。睾酮与CAF合成E2有浓度依赖性。加入10-7M睾酮，TAM处理48h可使CAF培养基中E2浓度由302.5±40.8pg/ml增加至541.8±68.7pg/ml（P=0.011），G15、AG1478、U0126和Wortmannin处理可使之分别降至353.8±43.5pg/m（lP=0.022）、345±52.8pg/m（lP=0.02）、328.5±36.8pg/m（lP=0.017）和520.2±42.8pg/ml（P=0.676）。G1及G15等处理后CAF培养基中E2的浓度有相同趋势的变化。TAM处理CAF18h后，细胞芳香化酶基因CYP19A1的表达上调到3.4±0.64倍（P=0.003），G15、AG1478、U0126和Wortmannin处理可使之分别降至1.3±0.22倍（P=0.006）、2.0±0.29倍（P=0.029）、2.0±0.31倍（P=0.036）和3.3±0.85倍（P=0.855）。G1等处理18h对CYP19A1基因表达的影响与TAM相同。结论：TAM可激活CAF中的GPER，通过GPER-EGFR-ERK通路促进细胞生长、增殖、伸展和迁移；该通路还可促进芳香化酶基因表达和E2合成，这些效应可能影响肿瘤细胞生物学行为，导致TAM耐受。靶向GPER可能是目前乳腺癌内分泌治疗必要的补充和完善。