本实验室前期构建了新型非抗性筛选皮质抑素和生长抑素双表达DNA疫苗C500（p VGS/2SS-2A-S/CST14-asd,以下简称工程菌）,生产成本低,可避免抗生素污染;免疫小鼠后取得了良好的增重效果,且未对小鼠造成不良反应,表明该疫苗安全高效,可用在畜牧生产中。为了评价该疫苗应用于大动物的免疫效果和安全性,本试验在对工程菌发酵培养基进行优化以提高疫苗产量的基础上,分别在不同季节以不同剂量免疫水牛犊牛,从免疫应答、犊牛增重、营养代谢等方面评价其免疫效果,筛选出最适合犊牛的免疫季节和免疫剂量,并从免疫后犊牛精神状态、基因整合、工程菌环境扩散等方面评价该疫苗的安全性,从而证实该疫苗应用于生产实际的可行性,为新型非抗性筛选皮质抑素和生长抑素双表达DNA疫苗的推广应用提供科学依据和技术支撑。主要研究内容与结果如下:1.工程菌的稳定性将鉴定正确的生长抑素和皮质抑素双表达质粒电转到猪霍乱沙门氏菌减毒株C500中,成功制备了工程菌。将工程菌传代50代,并从0代开始每隔10代检测工程菌的靶基因2A-S/CST、减毒基因Δcrp和侵袭基因inv A,发现关键基因均能稳定遗传,说明工程菌在传代过程中没有质粒丢失和毒力返强现象,并保留了沙门氏菌的侵袭力;此外,测定工程菌的存储稳定性,发现不同浓度的工程菌均能在4℃、25℃和37℃条件下分别保存72 h、48 h和12 h,成活率维持在75%以上。此后,随着时间的延长,存活率迅速下降。2.工程菌的发酵培养基优化用单因素实验对工程菌的有机碳源进行优化,发现:葡萄糖和半乳糖对工程菌的促生长效果优于其它糖类,二者在最适浓度下培养16 h的菌体量极显著高于对照组（P<0.01）;Plackett-Burman实验和爬坡实验结果表明,半乳糖、酵母浸粉和牛肉浸粉分别是影响工程菌生长最显著的有机碳源、复合碳源和复合氮源,三者的工作浓度分别在0.6%、0.7%和1.1%时工程菌的菌体量较高;用正交实验筛选三者促工程菌生长的最适浓度并进行发酵验证,发现:当半乳糖、酵母浸粉和牛肉浸粉的浓度分别为0.6%、0.8%和1.3%时,工程菌的菌体量最高。按此配方对工程菌进行发酵培养后,OD600增量和计数浓度分别较对照组增加了36.56%和36.63%。3.工程菌免疫水牛犊牛后的免疫应答在夏季（24头）和冬季（32头）选择2～4月龄犊牛,各分为4组,分别用4个剂量组（3×10~7、3×10~8、3×10~9和0 CFU/m L）进行鼻腔免疫处理。每头牛每天处理2次,每次15 m L,连续处理三天,并对其免疫效果进行评价。结果表明,各剂量组均能诱导免疫应答,无论在夏季还是冬季,均以低剂量组的免疫应答效果好,表现出较高的抗体水平和阳性率。比较抗体阳性牛（P组）和阴性牛（N组）的免疫反应,发现夏季阳性组IL-4和GH在初次免疫后2周、INF-γ在初次免疫后后7周以及IGF-1在初免后2周和7周均显著高于阴性组（P0.05）。4.工程菌免疫犊牛的促生长作用从日增重效果看,夏季免疫和冬季免疫各剂量组在初免后0～2 w、2～7 w和整个试验期的日增重均高于对照组,与免疫应答结果一致。低剂量组的增重效果最佳,夏季低剂量组犊牛日增重较对照组分别提高11.11%和4.62%,而冬季低剂量组日增重较对照组分别提高10.53%和7.81%,两组的增重效果相当。其中夏季阳性组日增重在初免后2周和整个试验期内显著高于阴性组（P<0.05）,分别增加16.28%和10.34%。5.工程菌的安全性分别于初次免疫后第1、3、5、11、18、25、35天采集水样、土样和粪样,稀释后涂布在麦康凯琼脂上,次日挑取可疑菌落用PCR方法扩增靶片段2A-S/CST,结果发现环境中不存在工程菌残留。采集犊牛血液样本,提取基因组DNA,用PCR扩增目的片段,检测犊牛体内是否存在外源基因整合,结果未能扩增出目的片段,说明犊牛基因组没有外源基因整合。综上所述,双表达疫苗具有良好的稳定性,经培养基优化后疫苗产量显著增加,疫苗免疫犊牛后起到了良好的促生长效果,低剂量组是此疫苗应用于水牛的最佳免疫剂量,而夏季免疫的免疫效果优于冬季免疫,且免疫后对机体和环境未造成不良影响。