柑橘大实蝇Bactrocera minax(Ederliein)是柑橘类果实的重要害虫之一,给柑橘产业带来重大经济损失。柑橘大实蝇于蛹期进入专性滞育使其躲避不利环境因素的伤害,从而保证种群的繁衍。海藻糖是昆虫的“血糖”,在昆虫生长发育和滞育方面起着重要的作用。本学位论文分析了柑橘大实蝇不同滞育时期代谢谱差异,并进一步深入研究了海藻糖合成途径中的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因(TPPB、TPPC1、TPPC2)的分子特性和功能,旨在为柑橘大实蝇滞育分子机理的研究提供理论依据。主要研究结果如下:1柑橘大实蝇不同滞育期代谢谱的分析本研究利用核磁共振波谱分析方法对柑橘大实蝇滞育前期(PreD)、滞育早(ED)、中(MD)、晚(LD)期以及滞育后期(PD)这5个时间点的样品进行了代谢组分析。主成分分析和最小二乘判别分析得到的柑橘大实蝇蛹期代谢谱差异与前期获取的基因表达谱差异相一致,两者都表明滞育早(ED)、中(MD)、后(LD)期的样品彼此差异不显著,三者与滞育前期(PreD)和滞育后期(PD)的差异显著。通过计算各代谢物VIP值,明确了对代谢组组间差异贡献最大的9种代谢物是脯氨酸、海藻糖、N-乙酰谷氨酸、琥珀酸、谷氨酸、丙氨酸和甘油磷酰胆碱、谷氨酰胺在以及2-氧基戊二酸。其中,脯氨酸和海藻糖的VIP值大大高于其他代谢物,并且在整个滞育期间浓度维持较高水平。脯氨酸和海藻糖在柑橘大实蝇越冬期间能起到冷冻保护剂的作用,保护个体免受寒冷伤害。2柑橘大实蝇BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2具有发育阶段和组织特异性利用qPCR与微滴数字PCR,对BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2在不同发育阶段及不同组织的表达水平进行了相对和绝对定量分析。相对定量分析表明:BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2在蛹期表达量低于幼虫与成虫期。此外,在整个发育阶段BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2三者之间略有差异。BmTPPB在表皮中高表达,BmTPPC1在马氏管中特异性表达,远远高于在其他组织中的表达量,而BmTPPC2在脂肪体中的表达水平最高。绝对定量分析表明:除了10日龄蛹外,BmTPPB转录本拷贝数占BmTPPs总拷贝数的比例在每个时间点上都高于其他两个基因;BmTPPC1在马氏管中的拷贝数比例最高;BmTPPC2在脂肪体中的拷贝数比例最高;BmTPPB在其他组织中的拷贝数比例最高。3 BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2蛋白质生物学信息分析BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2蛋白质序列分析结果显示都具有有HAD超家族的保守区域:motif I—DXXX—(T/V);motif II—(S/T)—GX;motif—III—K;motif IV—(G/S)—(D/S)—XXX(D/N)。motif I序列具有DxD特征,Motif II具有高度保守的苏氨酸或丝氨酸残基,Motif III以保守的赖氨酸为中心,其发生在α-螺旋区的N-末端部分周围,Motif II和III有助于水解中间体的稳定性。Motif IV的特征是有保守的酸性残基。Motif IV的酸性残基通常表现出以下三种特征之一:DD,GDxxxD或GDxxxxD(其中x是任何氨基酸)。柑橘大实蝇TPP Motif IV的标记由GDxxxD酸性残基表示。4柑橘大实蝇BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2基因异源表达以及活性分析采用毕赤酵母真核表达系统,分别构建BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2的重组蛋白表达载体,并在细胞内成功表达,获取纯化后的重组蛋白。对重组蛋白活性研究分析表明,BmTPPB在37.5℃、pH7.8的条件下酶活性最强,BmTPPC1在27.5℃、pH7.4条件下活性最强,而BmTPPC2在35℃、pH7.4的条件下酶活性最强。TPPC1对底物的亲和力高于TPPB和TPPC2,TPPC2酶促反应的速率最快。5基于RNAi技术的柑橘大实蝇BmTPPB、BmTPPC1、BmTPPC2功能验证采用显微注射的方法,将2.0μg ds-BmTPPB、ds-BmTPPC1、ds-BmTPPC2以及三者的混合液注射到柑橘大实蝇3龄幼虫体内。利用qPCR检测注射不同dsRNA后的基因沉默效率。结果显示,注射48 h后目的基因沉默效果显著,并且不存在相互干扰与脱靶效应。同时,BmTPP基因的干扰也导致了TPP酶活力与海藻糖含量下降,以及几丁质合成通路相关基因表达量的下降。综上所述,本学位论文分析了柑橘大实蝇不同滞育期代谢谱差异,筛选出与滞育密切相关的代谢物,其中包括海藻糖。随后另外全面解析了海藻糖合成途径中的BmTPPB、BmTPPC1与BmTPPC2的序列特征、时空表达模式以及在海藻糖合成中的作用。上述研究结果为进一步明确柑橘大实蝇海藻糖合成的生理机制,以及为进一步了解揭示柑橘大实蝇滞育的分子机理提供数据基础。