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目的:特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是指由不明原因引起的的慢性、进行性、纤维化性的间质性肺疾病(ILD)。目前认为:持续的肺泡上皮损伤导致上皮细胞间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与IPF关系最为密切。其中,高表达TGF-β1导致的smad分子信号过度激活是引起EMT重要机制。研究发现miRNA-21、let-7d表达异常与TGF-β1/smad信号诱导EMT密切相关,miRNA-21通过抑制smad7而促进TGF-β1/smad信号增强EMT过程,反过来TGF-β1可增强miRNA-21的高表达。自噬活性降低也与IPF有关,增强自噬活性可阻止TGF-β1/smad诱导的EMT,自噬是否以TGF-β1/smad信号介导的EMT为轴心参与miRNA的表达调控值得探索。基于上述问题,本研究探讨博莱霉素诱导的肺纤维化模型miRNA-21、let-7d和自噬活性的调控关系及其黄芪多糖、黄酮总皂苷、黄芪总黄酮的干预作用。为了进一步验证自噬和miRNA的表达调控关系以及筛查上述药物有效成分,实验通过TGF-β1联合自噬抑制剂3-MA干预A549细胞,检测自噬活性和miRNA-21和Let的表达关系;其次以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、异鼠李、山奈酚、槲皮素处理上述细胞模型,观察自噬活性及miRNA-21的表达变化,筛查黄芪皂苷和黄芪总黄酮的有效成分。方法:动物实验75只C57BL/6小鼠随机分为5组:假手术组、模型组、黄苗多糖组、黄芪总皂苷组、黄芪总黄酮组。模型组及药物处理组小鼠气管内一次性滴注BLM,假手术组予等量生理盐水建立特发性肺纤维化动物模型。造模成功后药物处理组分别予黄芪多糖284 mg·kg-1,黄芪总黄酮43mg.kg-1,黄苗皂苷:105mg·kg-1,模型组和假手术组予以等量生理盐水。干预28天后分2组取材,一组作肺泡灌洗,进行细胞计数和细胞涂片检查。另一组做病理及 miRNA-21、let-7d 和 LC3、P62、beclin-1、smad3、p-smad3、α-SMA,E-Cadherin等检测,比较各组肺组织形态及胶原蛋白表达水平,分析EMT、自噬活性和miRNA-21和let-7d的变化关系。为验证自噬活性对miRNA表达调控关系,TGF-β1联合自噬抑制剂3-MA干预A549细胞,检测miRNA-21及let-7d表达水平、smad3磷酸化水平和smad7变化、EMT标记蛋白α-SMA、E-Cadherin变化。以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、异鼠李、山奈酚、槲皮素各12.5umol/L干预,检测上述指标表达变化,比较六种成份的干预影响。实验结果1.黄芪组份对肺泡灌洗液细胞分类影响与假手术组比较,模型组肺泡灌洗液存在大量炎性炎性细胞(P<0.05),巨噬细胞明显增多(P＜0.01),黄芪多糖(P＜0.05)、黄芪皂苷(P<0.05)、黄芪总黄酮(P＜0.01)均可减少肺泡灌洗液(BLAF)炎性细胞数量,但黄芪总黄酮改善更显著。2.黄芪组份对肺组织病理形态影响HE染色显示:与假手术组比较,模型组肺组织炎症细胞浸润明显,黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪总黄酮均可减少炎性细胞浸润,但黄酮治疗组改善最显著(P<0.01)。masson染色显示:与假手术组比较,模型组肺组织胶原增生明显,呈实化状,肺组织结构紊乱;黄芪皂苷(P<0.01)、黄芪总黄酮(P<0.01)、黄芪多糖组(P<0.01)均能显著下调模型肺组织胶原蛋白表达水平,但黄芪总黄酮与黄芪多糖和黄芪皂苷比较均有显著性差异(P＜0.01),治疗效果最显著。3.黄芪组份对TGF-β1和TNF-α表达影响免疫组化结果提示,与假手术组比较,模型组肺泡腔,肺组织间隙大量表达TGF-β1和TNF-α(P<0.01),在肺结节外周更明显。与模型组比较,黄芪多糖(P<0.01)、黄芪皂苷(P<0.01)、黄芪黄酮(P<0.01)均可显著减少TGF-β1和TNF-α水平,与western-bloting结果一致,但与黄芪多糖和黄芪皂苷比较,黄芪总黄酮组更显著(P＜0.01)。4.黄芪组份对肺组织miRNA-21和let表达影响realtime-PCR结果提示:与假手术组比较,模型组miRNA-21水平上调(P<0.05),LET-7d表达下降(P<0.05),黄芪总黄酮可抑制miRNA-21表达(P<0.01),但对LET-7d影响不明显。而其他治疗组对miRNA-21和let-7d均无改善作用。5.黄芪组份对肺组织自噬活性影响与假手术组比较,BLM诱导的肺纤维化模型LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平显著降低(P<0.01),P62显著升高(P<0.01),说明自噬水平被显著抑制;与模型组比较,黄芪总黄酮和黄芪总皂苷均可显著提高LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1而抑制P62(P＜0.01),其他治疗组无效。6.黄芪组份对Smads分子信号和EMT标记蛋白表达影响与假手术组比较,BLM诱导肺纤维化过程中smad3磷酸化水平增高(P<0.01),smad7下降(P<0.01),α-SMA增强(P<0.01)而E-cadherin表达下调。黄芪皂苷和黄芪总黄酮干预后,肺组织smad7被上调,smad3磷酸化水平被抑制,同时α-SMA表达减少(P<0.01),E-cadherin升高(P＜0.01)。7.黄芪组份对TGF-β1联合3-MA诱导A549细胞miRNA-21和Let-7、自噬及TGF-β1/smad信号蛋白的影响。与空白组比较,TGF-β1诱导A549细胞LC3Ⅱ/Ⅰ、beclin-1表达下降(P＜0.01),p62升高(P<0.01),同时miRNA-21增高而Let-7d表达下调。自噬抑制剂3-MA可进一步增强miRNA-21表达而抑制Let-7d表达,即细胞活性下降与miRNA-21表达增高和let-7d表达降低具有关系。与模型组比较,槲皮素和黄芪甲苷逆转了 3-MA对细胞自噬的抑制作用,LC3Ⅱ表达上升而p62下调(P＜0.01),同时抑制了 miRNA-21表达,但对Let-7d表达无调控作用。毛蕊异黄酮对细胞自噬活性具有抑制作用,其他成分无显著影响。在自噬活性减弱时,靶蛋白smad7减少(P<0.01),smad3磷酸化水平增强(P＜0.01)。加入自噬抑制剂3-MA后,smad7进一步下调(P<0.01),smad3磷酸化水平增加(P＜0.01),α-SMA表达上升(P<0.01)。黄芪甲苷和槲皮素提高细胞自噬活性、抑制miRNA-21,同时提高smad7表达升高,smad3磷酸化水平下降,EMT作用减弱。说明自噬活性增强可通过smad信号对miRNA-21的表达具有调控作用。8.黄芪组份对PI3K/AKT/mTOR信号的影响本实验中利用TGF-β1诱导细胞,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-70s6k均增高(P<0.01),LC3Ⅱ表达下调(P＜0.01),证实TGF-β1通过上述信号抑制细胞自噬活性。但是黄芪甲苷和槲皮素对TGF-β1激活PI3K的途径并无影响,但对p-AKT p-mTOR、p-p70s6k均产生了抑制作用(P＜0.01),说明黄芪甲苷和槲皮素对肺纤维化的抑制作用不仅通过下调TGF-β1的表达,还可通过AKT/Mtor/P70S6K信号独立影响自噬活性,抑制肺纤维化发展。结论1.黄芪皂苷、黄芪多糖和黄芪总黄酮可显著抑制BLM诱导的肺组织炎症反应,减少炎性细胞聚集,抑制TGF-β1和TNF-α的过度表达,降低肺组织胶原蛋白水平,对肺纤维化均有不同程度治疗作用,但是黄芪总黄酮治疗作用比黄芪皂苷和黄芪多糖显著。2.黄芪总黄酮可抑制miRNA-21表达,但对let-7d无影响,黄芪皂苷和黄芪多糖对两种miRNA均无调节作用。3.黄芪总黄酮和黄芪皂苷激活肺组织自噬活性,黄芪总黄酮可能通过抑制TGF-β1/smad信号,抑制TGF-β1对miRNA-21从促进作用,减少α-SMA表达,抑制肺纤维化发展。4.TGF-β1介导自噬抑制和miRNA-21的上调和let-7d下调,自噬激活可能通过TGF-β1信号与miRNA-21相互调控。5.体外实验黄芪甲苷和槲皮素通过AKT/mTOR途径激活自噬,增强smad7对TGF-β1/smad信号抑制作用,下调miRAN-21表达,阻止EMT发展,该作用与PI3K无关。说明总黄酮不仅通过下调TGF-β1的表达,抑制肺纤维化,还可通过独立影响AKT/mTOR信号激活自噬抑制肺纤维化。