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第一部分:阿司匹林对小鼠颅骨骨溶解模型中骨丢失的抑制作用目的:观察阿司匹林干预钛颗粒诱导的颅骨骨溶解的效果。方法:将小鼠分为四个组:空白组,Ti组,低剂量阿司匹林组(Ti/5mg/kg阿司匹林)和高剂量阿司匹林组(Ti/30mg/kg阿司匹林)。将钛(Ti)颗粒制成混悬液后,予雄性C57BL/6J小鼠颅骨表面注射钛颗粒,建造骨溶解模型。空白组予以生理盐水注射于颅骨表面,两治疗组每日分别予以5和30mg/kg阿司匹林灌胃1次。灌胃2周后处死小鼠并取下各组小鼠颅骨,micro-CT扫描并重建各组颅骨,分析颅骨骨溶解情况,H&E染色分析小鼠颅骨侵蚀面积和BT,TRAP染色统计骨溶解处破骨细胞数量。结果:Micro-CT重建小鼠颅骨显示,相比于空白组,Ti组小鼠颅顶可见较多骨吸收小凹,阿司匹林药物处理组以剂量依赖的方式减少了颅骨吸收小凹的数量。此外,三维重建分析结果表明阿司匹林抑制了骨溶解周围骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)和骨密度(BMD)的降低,减轻了颅骨孔隙数目。H&E染色显示颅骨侵蚀表面积和骨厚度(BT)在Ti组是(0.1363±0.0071)mm~2,(0.088±0.0032)mm,而高剂量阿司匹林药组的颅骨侵蚀表面积和骨厚度分别是(0.0517±0.0033)mm~2,(0.1963±0.0130)mm,差异有统计学意义。阿司匹林药物处理组中骨丢失被显著抑制,其骨厚度也明显高于Ti组。TRAP染色分析表明低剂量和高剂量阿司匹林药物处理组的颅骨染色切片中,破骨细胞数分别为(20.67±2.333)个,(12.67±1.453)个,与Ti组破骨细胞数(35.67±4.333)个相比,存在统计学差异(P<0.01)。结论:阿司匹林通过抑制破骨细胞数量而抑制了钛颗粒诱导的颅骨骨质破坏。第二部分:阿司匹林对破骨细胞分化的抑制效应目的:观察阿司匹林对RANKL诱导破骨细胞形成的作用及其潜在机制。方法:我们应用BMMs和RAW264.7细胞系检测阿司匹林对破骨细胞分化的效应。过量麻醉处死C57BL/6J小鼠,从小鼠股骨和胫骨中取出骨髓,并培养BMMs。将BMMs细胞种板后行CCK-8试验检测阿司匹林对BMMs细胞活性的作用。同时,将BMMs种板后,用DMEM培养基、30ng/ml M-CSF和不同浓度阿司匹林(0,0.028,0.28,1.4m M)培养4h后,加入50ng/ml RANKL诱导5天,每三天更换诱导培养基。五天破骨细胞形成后,应用TRAP染色评估不同浓度阿司匹林对RANKL诱导破骨细胞分化的作用。此外,同等培养条件下,将BMMs细胞用于骨板吸收实验和鬼笔环肽染色来确定阿司匹林对破骨细胞F-actin环骨架结构和功能的作用。BMMs培养五天后,RT-PCR分析阿司匹林对破骨细胞相关基因表达的差异。同时,western blot分析技术研究阿司匹林对破骨细胞形成中MAPKs(p38,ERK,JNK),NF-κB和PI3K/Akt的作用。流式细胞计数和荧光显微镜检测阿司匹林对RANKL诱导ROS的效应。最后,应用western blot分析阿司匹林对RANKL诱导破骨细胞形成中NOX-4表达的影响。同时,免疫组化探讨颅骨中NOX-4在阿司匹林处理组表达的差异。结果:CCK-8试验中,在(0.0028-1.4m M)的阿司匹林浓度下,BMMs活性不受影响。在诱导培养基培养5天后,TRAP染色可见RANKL组中大量成熟破骨细胞,而在不同浓度阿司匹林药物处理组中,破骨细胞的数量呈浓度相关性递减。TRAP染色定量分析显示0.28m M和1.4m M阿司匹林处理组中TRAP阳性细胞数目分别为(48.67±5.487)个/cm2和(13±2.646)个/cm2,与RANKL组(189.3±12.24)个/cm2比较,存在统计学差异(P<0.01)。骨板吸收实验中0.28和1.4m M阿司匹林处理组的吸收面积与非阿司匹林处理组相比,分别下降了56.75%和64.33%(P<0.05)。鬼笔环肽荧光染色结果表明阿司匹林显著抑制了破骨细胞F-actin环的形成。此外,western blot结果显示RANKL促进了p-ERK、p-JNK、p-P38,以及c-Fos和NFATc1的表达显著增加,而阿司匹林显著下调了上述胞内因子蛋白的表达水平,而对p-IκBα、p-P65、p-AKT1的表达水平无明显调控。流式细胞技术和荧光显微镜结果表明阿司匹林抑制了RANKL诱导ROS的表达。Western blot分析验证了阿司匹林抑制RANKL诱导破骨细胞形成中NOX-4的表达。同时,免疫组化分析结果显示阿司匹林抑制骨溶解模型中表达量高的NOX-4分子。结论:阿司匹林通过抑制MAPKs和NOX-4抑制破骨细胞的分化、形态和功能。