论文部分内容阅读
维生素D是一种脂溶性类固醇衍生物，在人体钙、磷代谢及骨骼正常生理机能的维持中有着重要作用，1α，25-二羟维生素D3[1α，25-dihydroxyvitamin D3，1α，25-(OH)2D3]是维生素D的主要活性形式。研究表明1α，25-(OH)2D3对破骨细胞(osteoclast，OC)的分化与功能有调控作用，但是具体机制尚不清楚。本研究以RAW264.7细胞作为破骨细胞前体细胞(osteoclast precursor cell，OPC)，添加25 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)和30 ng/mL核因子κB受体活化因子配体(receptor activator ofnuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导其分化为OC，免疫荧光和蛋白质免疫印迹(Westernblot)方法研究维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)在细胞内的分布，实时无标记细胞分析技术(real time cellular analysis，RTCA)检测RAW264.7细胞增殖，实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测OC标志基因表达，利用双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和质谱鉴定技术建立了1α，25-(OH)2D3调控OC分化的蛋白差异表达谱，并对差异蛋白进行了质谱鉴定，主要结果如下: 1.RAW264.7细胞及OC均可表达VDR，细胞膜、细胞质、细胞核中都有VDR存在，但是O、10-9、10-8、10-7 mol/L1α，25-(OH)2D3处理，RAW264.7细胞增殖无显著区别。10-8mol/L浓度1α，25-(OH)2D3可极显著促进OC分化，处理5d时极显著上调TRAP、CK、MMP-9基因表达，而极显著抑制CAⅡ基因表达。 2.对OC分化第1、3、5 d1α，25-(OH)2D3处理组与空白对照组的蛋白差异表达谱进行分析，检测到23个差异表达蛋白点，质谱鉴定为22种蛋白质，对其中19种蛋白质进行基因本体(Gene Ontology，GO)和STRING分析。结果显示，基于分子功能，差异蛋白质可聚集到蛋白质结合等12个GO term;基于生物学过程，这些蛋白质能够聚集到负调节凋亡过程等14个GO term;基于细胞组成，这些蛋白质能够聚集到14个GO term上，在细胞内外均有分布;STRING分析显示大部分差异蛋白质存在或可能存在相互关联。根据结果推测，1α，25-(OH)2D3可能通过促进能量代谢，细胞黏附，抑制细胞凋亡促进OC生成。 3.应用qRT-PCR方法对丙酮酸激酶、核仁磷酸蛋白1、蛋白质二硫键异构酶A3、巨噬细胞迁移抑制因子、半乳糖凝集素3、膜联蛋白A2、SH3域结合谷氨酸富含样蛋白3、延长因子1-α1这8个差异蛋白质进行验证，结果显示，除延长因子1-α1基因表达没有显著变化外，第3d丙酮酸激酶和第5d蛋白质二硫键异构酶A3基因表达水平与2-DE中蛋白表达变化一致，其余蛋白质基因表达水平与蛋白表达变化不一致，可能存在转录后调控机制，1α，25-(OH)2D3对OC分化过程中这些蛋白的作用值得深入研究。