研究背景与目的:肺癌仍是全世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,部分晚期NSCLC（Non-small cell lung cancer）即使给予精准放化疗、靶向及免疫治疗等,仍快速出现药物耐药从而导致疾病的进展。有研究显示,细胞骨架相关蛋白4（Cytoskeleton-associated protein 4,CKAP4）是一种可逆棕榈酰化的Ⅱ型跨膜蛋白,主要定位于细胞膜和粗面内质网上,同时是多种配体的受体,在稳定蛋白结构中发挥着重要作用。有研究报道,CKAP4在恶性肿瘤中发挥着促进肿瘤发生或抑制肿瘤发展的作用。在肺腺癌中,CKAP4可促进腺癌细胞的生长和转移,但CKAP4是通过何种作用机制发挥作用的?目前鲜有研究报道。因此,本课题通过使用NSCLC组织基因测序结果、生物信息学工具分析等,从临床水平、细胞水平和动物水平方面研究CKAP4调控肺腺癌的分子机制,并验证CKAP4与其下游信号通路在参与调控肺腺癌细胞增殖过程中的具体作用。本课题有助于进一步研究肺腺癌在多组学层面的异常,阐明肺腺癌发生和进展的新的分子机制,为新型靶向药物的研发提供更好的理论依据,具有极为重要的医学转化意义。研究方法:1、使用3例一线免疫治疗后药物抵抗和3例免疫治疗后部分缓解的NSCLC石蜡包埋组织进行二代基因测序并筛选出差异表达基因,并通过生物信息学网站分析相关基因在肺腺癌组织中差异表达情况及对诊断和生存预后的影响。2、通过western blot和RT-PCR实验分析CKAP4在肺腺癌术后新鲜肿瘤组织和肺腺癌细胞中蛋白和m RNA表达水平;收集NSCLC石蜡包埋组织,通过单因素和多因素Logistic分析CKAP4表达与NSCLC临床病理信息相关性。3、通过western blot和RT-PCR验证在肺腺癌细胞系中的小干扰RNA（si CKAP4）和过表达质粒（CKAP4-ox）对CKAP4表达效率的影响。4、通过划痕、CCK-8、Ed U、transwell小室、流式细胞实验观察上调和抑制CKAP4表达对肺腺癌细胞生物学行为的影响;并进一步通过western blot法验证CKAP4对肺腺癌细胞凋亡相关蛋白的影响。5、利用TCGA数据库、Web Gestalt数据库和GSEA通路富集分析筛选出与CKAP4可能相关的下游信号通路,并通过western blot法验证上调和抑制CKAP4表达后对该信号通路蛋白表达的影响。6、通过生物信息分析网站筛选出与CKAP4存在相互作用且有潜在结合序列的上游miRNA,同时明确该miRNA与CKAP4表达之间的相关性。7、通过RT-PCR和western blot法验证miR-133b过表达（mimics）和抑制剂（inhibitor）对下游CKAP4的m RNA和蛋白表达水平的影响。8、构建CKAP4野生型和突变型质粒,通过双荧光素酶实验验证miR-133b和CKAP4是否存在结合位点、特殊结构域及相互作用。9、通过细胞功能表型实验验证抑制或上调miR-133b表达后对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、转移和凋亡的影响;western blot法检测抑制和上调miR-133b后对凋亡相关蛋白表达水平的影响。10、将miR-133b-mimics和CKAP4-ox过表达质粒共转染肺腺癌细胞后,通过细胞回复实验进一步明确共转染组是否能够反转挽救miR-133b-mimics组和CKAP4-ox组对肺腺癌细胞生物学行为的影响。11、通过生物信息分析网站和western blot法检测抑制和上调miR-133b表达后对下游CKAP4和信号通路相关蛋白表达的影响。12、通过慢病毒感染肺腺癌A549细胞后,构建裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察裸鼠肿瘤体积生长曲线、瘤体重量和免疫组化染色等变化,明确沉默CKAP4表达后肺腺癌细胞对裸鼠体内成瘤和增殖能力的影响。研究结果:（一）CKAP4在肺腺癌中的表达及其临床意义1、将NSCLC二代组织基因测序结果进行标准化处理共筛选出83个上调基因和280个下调基因,并利用生物信息学数据库和结合相关文献共筛选出6个差异表达基因:MAGED1,CKAP4,MDH2,FKBP4,MRPL12和TUBG1。对比肺正常上皮系BEAS-2B和肺腺癌术后相对应新鲜癌旁组织,CKAP4在肺腺癌细胞系和肺腺癌肿瘤组织中高表达,低表达预后好。因此,将候选目的基因确定为CKAP4。2、免疫组化染色提示CKAP4蛋白主要定位在细胞膜和细胞质中,在NSCLC肿瘤组织、远处转移组织中高表达,且多因素Logistic分析结果提示血NSE、PD-L1（22c3）是影响CKAP4表达的独立危险因素。（二）CKAP4通过PI3K-AKT信号通路促进肺腺癌细胞增殖及转移1、肺腺癌细胞经转染CKAP4过表达质粒（CKAP4-ox）和小干扰RNA（si CKAP4）后能够明显影响肺腺癌细胞中CKAP4的m RNA和蛋白表达水平。2、下调CKAP4表达后肺腺癌细胞迁移、增殖、侵袭及转移能力明显下降,而细胞凋亡率增加;过表达CKAP4后肺腺癌细胞迁移、增殖、侵袭及转移能力明显增强,而细胞凋亡率下降。3、TCGA、Web Gestalt数据库和GSEA通路富集分析提示CKAP4表达与PI3K-AKT信号通路密切相关,且western blot结果提示抑制和过表达CKAP4后磷酸化P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白表达水平均明显改变,而非磷酸化PI3K、AKT、m TOR蛋白表达水平无明显变化。（三）miR-133b通过CKAP4/PI3K-AKT信号轴调控肺腺癌细胞增殖及转移1、为明确CKAP4被调控的上游miRNA,将UCSC数据库中肺腺癌差异表达有意义的miRNA与Target Scan和starbase数据库中CKAP4有结合序列的miRNA共交集出11个。miR-133b在肺腺癌肿瘤组织中低表达,与CKAP4存在相互作用的结合序列,且两者之间相关性较强、有负向相互调控关系。2、抑制和上调miR-133b表达后可以明显影响CKAP4的m RNA和蛋白表达水平。3、双荧光素酶实验提示miR-133b可以直接负向调控CKAP4表达,且两者之间有相互作用的结合位点,因此,将CKAP4上游调控基因确定为miR-133b。4、上调miR-133b表达后肺腺癌细胞迁移、增殖、侵袭和转移能力明显下降,而细胞凋亡率增加;抑制miR-133b表达后,上述细胞生物学行为作用相反。5、细胞回复实验提示将miR-133b-mimics和CKAP4-ox过表达质粒共转染肺腺癌细胞后,共转染组可以反转挽救miR-33b-mimics组和CKAP4-ox组对肺腺癌细胞迁移、增殖、侵袭和凋亡的影响。6、抑制和上调miR-133b表达后可以负向调控肺腺癌细胞中CKAP4蛋白表达,且磷酸化P-PI3K、P-AKT、P-m TOR蛋白表达水平均出现明显变化,而非磷酸化PI3K、AKT、m TOR蛋白无明显变化。（四）裸鼠体内成瘤实验观察CKAP4对肺腺癌细胞增殖和侵袭的影响1、建立用慢病毒感染A549肺腺癌细胞系的裸鼠皮下移植瘤模型,肿瘤生长-体积曲线图和瘤体重量结果提示沉默CKAP4表达后可以减慢裸鼠体内移植瘤生长速度。2、裸鼠肿瘤组织RT-PCR和western blot结果提示沉默CKAP4表达后CKAP4的m RNA和蛋白表达水平均下降。3、免疫组化染色提示沉默CKAP4表达后,CKAP4、Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl2表达水平均下降,而促凋亡蛋白Bax和caspase7表达水平升高。结论:1、CKAP4在体内外实验中均可促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭。2、CKAP4高表达与NSCLC患者区域淋巴结和远处转移、血NSE、PD-L1表达密切相关,低表达预后好,是肺腺癌诊断和预后的重要生物标志物。3、miR-133b直接负向调控CKAP4表达,通过抑制下游PI3K-AKT-m TOR信号通路,从而抑制肺腺癌细胞生长、转移及促进细胞凋亡。