论文部分内容阅读
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是一种重要的医药原料，本文力图构建了一种新的胞外酶促转化法来生产SAM的反应体系，即固定化SAM合成酶(MAT)酶促反应与产氨短杆菌发酵生产ATP相耦联以生产SAM，并且对此体系中的相关技术进行了研究。首先通过对SAM合成酶分泌型菌株的发酵策略进行优化，而获得MAT，然后将盐析后的粗酶进行固定化，再将酶促反应体系和ATP的生产体系相耦联，以克服传统胞外酶促转化法的缺陷。具体结果如下：
首先对毕赤酵母生产MAT的条件进行比较和优化。传统策略A中，pH恒定控制在6.0，单一甲醇补料，而新策略B中，在诱导后期pH逐渐增加至8.0，在策略C中，将逐渐升高pH方式与混合流加甘油和甲醇方式相结合，结果显示，采用策略C最有利于MAT的积累，MAT活性最高值可以达到213 U/1。
然后对发酵液中MAT进行盐析，得到350U/1的浓缩粗酶液，以ABSE-交联琼脂做为载体进行固定化，最后得到优化条件：固定化时间为3-5小时，pH为8.0，得到70U/g的固定化MAT酶。相同酶反应条件下，反应周期为30分钟，固定化SAM合成酶连续反应7次之后的酶活仍能达到最初的95％。固定化SAM合成酶反应的pH范围比游离酶的要宽，前者在7.5到8.7的pH条件下，酶反应的转化率可以达到90％以上。在pH8.0，4℃下储藏3天后，固定化SAM合成酶的残留酶活为最初的97％，同样条件下储藏一周后，其残留酶活则为最初的88％。
最后利用产氨短杆菌在添加腺苷的条件下生产ATP，并将该生产体系与固定化SAM合成酶耦联酶反应生成SAM的初步反应体系进行了尝试，耦联反应6小时后SAM积累量达到30.12mg/g固定化酶，初步打通了体外合成SAM的反应体系。此时，固定化酶酶活仍然有63U/g，为初始固定化酶酶活的90％。