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背景:创伤性骨关节炎（Post-traumatic osteoarthritis,PTOA）是由膝关节韧带、半月板、滑膜或膝关节软骨创伤引起的软骨损伤疾病,具体发病机制仍不清楚。目前,研究认为生物化学因素和生物力学因素异常改变可能为PTOA的主要致病因素,但相对致病作用不能确定。理想的前交叉韧带重建（Idealized anterior cruciate ligaments reconstruction,IACL-R）模型尽管成功模拟和重现人体ACL-R术后发生PTOA的病理过程,但其膝关节生物力学特性是否恢复、力学干扰因素是否排除仍需进一步科学验证。此外,较多小动物（鼠、兔）实验仅证实膝关节创伤1周内关节腔局部出现大量炎症因子、基质降解酶类等,触发关节软骨退变。但缺少动态、系统、全面、全程的关于炎症因子变化相关实验报道,大动物报道更是少之又少。机制不清,病因不明,对PTOA疾病的诊疗相对盲目、被动。α-2巨球蛋白（alpha-2-macroglobulin,α2M）是一种生物体液中的高分子糖蛋白,具有广谱的蛋白酶抑制作用,有特殊的关节软骨保护作用。随着研究的深入,α2M的瓶颈问题不断凸显,如产量有限、安全隐患等问题限制研究的进一步开展。富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）在全身软组织疾病中得到广泛的应用。受其启发,探索一种更加简单的富集血清中α2M（α2M-Rich Serum,α2MRS）的方法并观察其对PTOA疾病的治疗效果具有非常重要的研究价值。目的:1.探索、掌握富集血清中α2M的方法,检测α2MRS中α2M的蛋白浓度及富集系数。2.制备小型猪IACL-R模型,步态分析仪检测膝关节的步态参数变化,粗略评估其生物力学恢复特性。3.小型猪IACL-R术后关节腔注射α2MRS,观察其对PTOA关节软骨的保护作用并初步探讨其机制。方法:1.超速离心法富集血清中α2M。采用Cytonics超滤离心杯（100KD）浓缩健康血清,用不同离心力（3000g、4000g、5000g）,不同离心时间（20min、30min、40min）离心,最后获取上层浓缩液和下层滤过液。采用酶联免疫吸附实验（Elisa）检测α2M浓度,蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）,考马斯亮蓝进一步验证浓缩、富集效果。2.PTOA发病机制探究及α2MRS疗效观察。小型猪18只,18月龄,雌性。右后肢（right hind foot,RH）行IACL-R制造PTOA模型。左后肢（left hind foot,LH）不做任何处理。第一组:Sham组,RH仅行关节囊切开,生理盐水关节腔注射（n=6）第二组:IACL-R组,RH行IACL-R术,生理盐水关节腔注射（n=6）第三组:IACL-R+α2MRS组,RH行IACL-R术,α2MRS关节腔注射（n=6）术前（0天）、术后（7、15、30、45、60、75、90天）不同时间点行步态采集并分析;术前（0天）、术后不同时间（3、6、14、29、90天）点关节液采集,行Luminex悬液芯片技术检测关节液炎症因子;术后不同时间点（2、6、14、29天）α2MRS及生理盐水关节腔注射;术后3月安乐处死,膝关节影像学检查并评分,大体观察并评分,组织学检查并评分。结果:成功富集血清中α2M,结果较为理想;初步明确小型猪IACL-R模型的步态特性及炎症因子变化趋势;α2MRS对PTOA关节软骨的保护作用得到初步验证。1.Cytonics超滤离心杯（100KD）,30min,5000g条件下富集血清中α2M较为理想:血清原液α2M浓度（2.28±0.26mg/ml）,浓缩液α2M浓度（11.13±0.90mg/ml）,滤过液α2M浓度（0.000049±0.00001 mg/ml）。α2M的回收率为97.66%、富集系数为4.88。2.步态分析结果:IACL-R组小型猪能有效恢复步态特征但晚于IACL-R+α2MRS组。Sham组小型猪术后15天步态指标恢复到术前状态;IACL-R组在术后45天恢复到正常,后期（75天）再次出现恶化;IACL-R+α2MRS组术后30天恢复到正常,一直保持到安乐处死,效果显著优于IACL-R组。3.Luminex悬液芯片技术检测结果:白介素（Interleukin,IL）在所有关节液标本中变化较为显著。Sham组术后早期升高,29天后基本回落的初始水平;IACL-R组术后早期显著升高,后期（术后29天）显著回落,最后期（术后90天）又有所上升;IACL-R+α2MRS组术后早期保持较高浓度,后期显著回落,整体浓度显著低于IACL-R组。4.影像学检查（X线,三维重建CT,MRI）结果:IACL-R组退变重于IACL-R+α2MRS组。Sham组小型猪PTOA表现轻微,IACL-R组表现明显,IACL-R+α2MRS组PTOA表现轻于IACL-R组。MRI检查更为敏感,评分具有显著差异。5.关节软骨大体观察及OARSI评分结果:IACL-R+α2MRS组评分显著低于IACL-R组,但高于Sham组。Sham组膝关节软骨表面光滑、平整、乳白色,边缘光滑,无明显骨质突起,且评分较低;IACL-R组关节软骨表面破坏严重,软骨缺损明显,裂隙较深,关节边缘有一定骨赘形成,尤其在滑车关节边缘,且评分较高;IACL-R+α2MRS组膝关节软骨表面毛糙、纤维化,偶有较小缺损,骨赘较少,损伤程度显著轻于IACL-R组。6.番红“O”染色结果:IACL-R+α2MRS组软骨退变显著轻于IACL-R组。Sham软骨表面完整,蛋白多糖含量丰富且评分较低;IACL-R软骨表面破坏明显,蛋白多糖含量明显下降,软骨细胞数量显著减少、形态各异且评分较高;IACL-R+α2MRS组软骨厚度正常、表面纤维化改变,软骨细胞数量、形态较为正常且评分显著低于IACL-R组。7.免疫组化结果:IACL-R+α2MRS组COLL-II着色显著深于IACL-R组,但浅于Sham组;MMP-13相反。II型胶原在IACL-R+α2MRS组的阳性表达强于IACL-R组,但两组均低于Sham组。MMP-13的免疫组化染色恰好相反,IACL-R+α2MRS组的阳性细胞染色明显比IACL-R组弱,但两组均高于Sham组。实验结果有利于PTOA发病机制的进一步明确,对α2MRS的进一步临床转化提供理论基础。结论:1.Cytonics超滤离心管（100KD）,5000g,30min的离心条件下富集血清中α2M操作较为简单,结果理想,适合进一步推广2.小型猪IACL-R动物模型能有效恢复膝关节的步态特性,可初步排除PTOA发病过程中的力学干扰因素,有望用来独立评估炎症因素在PTOA疾病发生、发展中的作用3.早期、多次关节腔注射α2MRS能显著降低炎症因子浓度,能显著减缓PTOA关节软骨退变,具有明显的正性治疗作用