肝癌的发生、发展是多因素、多基因和多步骤的复杂过程，学者们对其发生、发展的具体机制仍在不断探索之中。慢性肝炎病毒感染（HBV/HCV）是导致肝硬化发生的最主要原因，肝硬化是HCC发生的重要危险因素，近1/3的肝硬化患者最终发展至HCC。近年来，越来越多的证据显示机体代谢失调也与HCC的发生有关，FXR作为体内重要的核受体之一，对胆汁酸、糖类、脂类的稳态起到重要的调节作用，近年来的研究表明，FXR在肝脏再生、炎症甚至肝细胞癌的发生中均起到一定的调节作用。本研究明确了FXR在肝脏炎症、肝纤维化、肝细胞癌不同发生阶段的作用并探讨了部分作用机制，本研究的意义不仅在于进一步揭示FXR的功能，也为HCC的发生机制的研究提供了新的视角并为治疗及预防提供了新的靶点。本研究取得了如下的结果：1.FXR对二硝基乙二胺（DEN）造成急性肝损伤的作用本研究首先比较了在DEN急性作用下FXR缺陷小鼠(FXR-/-)与野生型小鼠（Wild-type）对其反应差异，结果证实在缺少FXR的保护作用下，小鼠肝脏表现出对DEN的敏感性增强，表现为转氨酶升高，肝细胞凋亡增加及细胞因子的释放增多，无论是炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及肝细胞再生相关因子TGF-α、HGF在FXR缺失肝脏中表达升高更明显。此外通过EMSA方法证实NF-κB转录活性也升高，但是在FXR-/-小鼠中变化更为明显。为了明确FXR对NF-κB的调节作用，在体外环境下，我们证实FXR激活后对肝癌细胞系及原代小鼠肝细胞中NF-κB介导的炎性因子（TNF-α、IL-6、COX2）表达具有显著的抑制作用，而在FXR缺陷肝细胞中，NF-κB介导的炎性因子的活化不能被抑制。结果说明FXR缺失小鼠肝脏对DEN造成肝损害敏感性增强的原因可能由于其缺乏对NF-κB的抑制作用，导致NF-κB过度激活及炎症反应的发生。2. FXR在DEN造成小鼠HCC形成中的作用本研究中，成功建立了DEN诱导的wild-type小鼠及FXR-/-小鼠HCC模型，FXR基因缺失可导致小鼠对DEN的敏感性增加，FXR缺陷的小鼠显示更高的成瘤率，表现出肿瘤结节更多、肿瘤体积更大的特点。在对组织细胞凋亡及增殖检测中，我们发现FXR-/-小鼠肝癌组织细胞凋亡及增殖活性均较wild-type小鼠明显，除此之外，肝内炎症反应也明显增强。在进一步针对组织标本检测中我们发现，细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平在癌组织中基因表达均高于周围正常组织，而TNF-α与IL-6在FXR-/-小鼠的癌及癌旁组织均较wild-type小鼠升高，尤以癌组织变化更为明显。通过EMSA实验证实NF-κB的转录活性无论是在癌组织还是癌旁组织较wild-type小鼠比较均明显增强。为了进一步研究DEN诱导wild-type和FXR-/-小鼠产生差异表型的分子学变化，我们检测了与肿瘤发生关系密切的因子表达情况，结果显示：在两组小鼠中，CyclinD1及CyclinE在肿瘤组织中的表达水平均高于相应的癌周组织。与wild-type小鼠比较，CyclinD1及CyclinE的表达无论在FXR-/-小鼠的肝癌组织还是癌周组织中均有所升高，尤以癌组织升高明显；P53蛋白在FXR-/-小鼠肿瘤及癌旁组织表达水平低于wild-type小鼠，尤其在肿瘤组织其表达受到明显抑制。进一步的体外研究结果提示上调FXR表达并不能影响UV诱导的P53表达。其机制还需要深入探讨。3.FXR对肝纤维化形成的影响在DEN慢性损伤小鼠模型中，FXR-/-小鼠中，TGF-β1及TIMP-1mRNA表达明显高于wild-type小鼠，说明在FXR缺失条件下，组织发生肝纤维化程度更加明显。为了进一步验证FXR与肝纤维化的关系，我们成功分离了wild-type及FXR-/-小鼠的肝脏星状细胞（HSC），加入FXR激活剂GW4064作用后，在TGF-β1作用下，检测TGFβ1靶基因PAI-1, α-SMA和Collagenα1的mRNA表达情况，同时我们也检测了FXR的靶基因SHP的表达情况。结果证明，HSC存在FXR的表达，激活FXR表达后能够显著抑制TGF-β1诱导的纤维化相关因子的表达，而在FXR缺失组未见到明显抑制效应。而在检测SHP表达中也意外发现TGF-β1能够下调SHP的表达。综合上述结果，FXR具有保护TGF-β1诱导肝纤维化的作用，同时在肝纤维化形成过程中TGF-β1分泌的增加还可抑制HSC中FXR的激活而加速肝纤维化的进程。4.人HCC组织标本中FXR表达情况本研究进一步检测了FXR在人肝癌组织表达情况。共选取了41例确诊肝癌患者的术后组织标本（包括肝癌组织及癌周正常组织），通过定量PCR及免疫组化染色，评价了FXR相关基因及FXR蛋白在癌组织及癌旁组织的表达情况，检测结果提示FXR及FXR靶基因SHP在癌旁组织的表达明显低于癌周正常组织。进一步检测了前期Microarray结果中证实了在wild-type与FXR-/-小鼠肝脏表达差异最显著的基因，这些基因与细胞代谢、增殖及炎症相关。结果与我们预期相似，与正常肝组织比较，8个基因在人类HCC及FXR-/-小鼠肝脏表现出相似的上调或下调。在FXR-/-小鼠肝脏表达下调的基因CXCL1,DPYS, CD36, LIP1, SOCS3在人HCC中同样表达下调。其中FXR的靶基因SOCS3, CD36, LAGLS1已被证实与肿瘤的发生及发展密切相关。我们检测了FXR启动子的甲基化水平，在FXR的启动子区未发现典型的CpG岛，用去甲基化剂作用HepG2细胞72h，检测FXR基因表达情况，结果显示，FXR的表达在5-Aza-dC作用前后无明显变化。说明FXR下调与其启动子的高甲基化水平无明显相关。5.炎性因子对FXR转录活性的影响为了进一步探讨FXR下调的机制，小鼠肝脏原代肝细胞被分离培养，在培养体系中分别加入不同浓度的TNFα, IL-1β or IL-6。我们观察到在TNFα (10ng/ml), IL-1β (50ng/ml) and IL-6(1ng/ml)可以明显降低FXR mRNA的表达。为了明确FXR的表达是否与其启动子活性降低有关，将包含有HNF-1α结合位点(p150/+129)的人FXR启动子序列插入含有荧光素酶（luciferase）报告基因的pGL-3载体中，构建重组质粒报告质粒转染HepG2细胞及Hep3B细胞，转染24h后，分别在培养体系中加入TNFα, IL-1β, or IL-6（10ng/ml,50ng/ml）作用24h，应用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，结果显示，在HepG2细胞中，底物中的luciferase活性明显降低，说明FXR启动子的活性受到抑制，在Hep3B中重复上述实验我们得出了相同的结果，尤其在高浓度的IL-1β、TNF-α作用下，抑制作用更明显。如将突变序列的FXR启动子报告质粒(pGL3mut)转染HepG2细胞，在同样的条件下，底物中的luciferase活性无明显变化，FXR启动子的活性没有受到抑制。结果说明炎性因子可以通过HNF1α使FXR的转录活性下降。进一步检测了炎性因子对HNF1α基因蛋白表达的影响，结果显示细胞因子对HNF1α的基因及蛋白表达无明显的抑制作用。为了进一步明确炎性因子对FXR的下调机制，应用染色质免疫共沉淀(CHIP)实验检测了炎性因子TNFα对HNF1α DNA结合活性的影响。结果显示：加入IgG抗体的对照组在TNFα的刺激作用下，对FXR结合活性没有影响，而加入HNF-1α抗体组在TNFα刺激后与未处理组比较，HNF-1α与FXR启动子的结合活性明显下降，差异有显著性。为了进一步确定其对肝癌细胞的作用，在另一个肝癌细胞系Hun-7中重复了上述实验，得到了同样的结果。上述结果提示炎性因子可以通过降低HNF1α与FXR启动子的结合活性从而使FXR的转录活性下降，导致FXR表达降低。