牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消化系统疾病,副结核分枝杆菌能引起感染牛的产奶量下降、持续性消瘦、顽固性下痢甚至死亡,给畜牧业带来了巨大的经济损失,同时有研究表明该菌与人的克罗恩病有关,因此该病引起了研究人员越来越多的关注。副结核分枝杆菌属于胞内寄生菌,具有较强的环境抵抗力,牛通常在幼年期经口感染该菌并具有一个较长的亚临床期,后期才表现出临床症状。目前对于牛副结核病尚无有效的治疗方法,及时发现并淘汰感染牛是净化牛场最有效的方法,由于机体感染该菌后存在细胞免疫与体液免疫分离的特点,给该病的及时检测带来了很大困难,前期研究发现该病在感染前期以细胞免疫为主并伴随着间歇排菌,经过2到5年亚临床期后体液免疫应答增强,同时排菌量明显增加,针对感染后的不同时期,几种检测方法的敏感性与特异性存在较大的差异,加之副结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌以及其他环境分枝杆菌存在高度同源性,给牛副结核病诊断带来了很大的困难。所以,建立理想的牛副结核病检测方法有利于及早发现感染牛并及时淘汰出群,对该病在牛场净化具有很大的帮助。基于牛副结核病的免疫学规律,研究副结核病的诊断方法,以及不同诊断方法适用于副结核感染的不同时期具有重要意义。本论文主要研究了牛副结核病原学检测和体液免疫检测方法,并对所建立的方法与常规变态反应进行了比较,分析了各种方法检测的特点。病原学检测方法研究中,本研究将草分枝杆菌用甘油琼脂复苏后,转接到甘油肉汤培养基中扩大培养,采用蒸馏法,结合石油醚反复抽提,成功制备了草分枝菌素。将草分枝菌素按1%加入潘氏培养基中,成功制备适合副结核分枝杆菌生长的培养基。用副结核分枝杆菌参考株P18对制备的培养基进行了验证,结果表明,本研究制备的副结核培养基对副结核分枝杆菌具有良好的培养能力。根据副结核特异性插入序列IS900,设计引物一对特异性引物(IS900 F和IS900 R),建立了能够检测副结核分枝杆菌的特异性PCR方法,并用4株副结核分枝杆菌,以及牛结核分枝杆菌、草分枝杆菌、禽结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌进行了验证,证实了该方法良好的敏感性和特异性。使用建立的PCR检测方法,对山东地区采集的300份粪便样品进行检测,其中有38份为阳性。血清学检测方法研究中,我们采用大肠杆菌原核系统,克隆表达了5个副结核特异性蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963,将表达产物纯化并定量后,初步建立针对各蛋白抗体的ELISA检测方法,并用临床样本对5个重组蛋白在血清学诊断中的作用进行研究,结果MAP0862与MAP1345具有较好的诊断价值,对300份临床血清的检测结果表明,两者与IDEXX牛副结核检测试剂盒的符合率分别为94.3%与93.7%。同时还将具有良好抗原性的两个基因MAP0862与MAP1345进行串联表达,并探索串联表达蛋白在血清学诊断中的作用,结果串联表达的MAP0862-1345与两个蛋白在单独存在的情况下诊断效果类似,其与IDEXX副结核检测试剂盒的总符合率为92.7%。使用初步建立的基于不同副结核特异性蛋白的间接ELISA方法对实验室保存的人工感染副结核后不同时期的牛血清进行检测,研究感染后不同时期血清中针对几种特异性蛋白的抗体变化规律。通过对特异性表达蛋白的结构分析,选择各蛋白强抗原表位进行了化学合成,探索合成多肽在血清学诊断中的作用,结果基于MAP0862的2#多肽与基于MAP1345的3#多肽具有良好的诊断价值。对山东某牛场300头青年牛分别用本研究所建立的PCR方法和针对特异性蛋白的ELISA方法,以及经典的皮肤变态反应,商品化ELISA方法进行了检测,结果表明使用不同的检测方法检测结果存在差异。本研究初步建立了适合于牛副结核病诊断的细菌培养、PCR检测和抗体诊断方法。