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纤溶酶是一种天然存在的蛋白质,能够溶解血液中的栓块,使血液的流通恢复顺畅。它的发现为解决一直严重威胁着人们生命健康的血栓性疾病提供了可能,因而引起了众多研究者的关注。试验以豆渣作为发酵基质,以对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)底物法作为检测酶活性的方法,以考马斯亮蓝法作为检测蛋白质浓度的方法,以纤溶酶活性和蛋白质浓度为检测指标,研究了米曲霉3.800和黑曲霉3.4309双曲霉混合发酵豆渣产纤溶酶的最优发酵条件、纯化步骤及双曲霉纤溶酶酶学性质。从实验室现有菌种米曲霉、黑曲霉中筛选试验菌株,比较相同条件下米曲霉3.800、黑曲霉3.4309分别发酵豆渣与米曲霉3.800和黑曲霉3.4309双曲霉混合发酵豆渣产纤溶酶的活性,发现双曲霉混合发酵产纤溶酶活性高于单一菌种发酵,双曲霉混合发酵产纤溶酶活性为1.1026TAME单位/mL,分别为米曲霉3.800和黑曲霉3.4309纤溶酶活性的2.14倍和1.65倍,并且产酶高峰时间提前了12h,产酶最适时间为72h。因此试验采用双曲霉混合发酵豆渣产纤溶酶的研究方法。通过单因素试验确定了双曲霉混合发酵产纤溶酶的最佳条件,接种量为10%,黑曲霉3.4309与米曲霉3.800的配比为1：4,培养基的最佳碳源为麸皮,C/N为0.25,初始pH值及初始含水量分别为7.0和75%,最佳发酵温度为30℃。在单因素试验的基础上进行了响应面法Box-Behnken设计,选取培养基的C/N、初始pH值、初始含水量3个因素进行优化,得到了影响双曲霉混合发酵产纤溶酶的多项数学模型,并利用Design-Expert.8.05b对该模型进行求解可知,相应的最优工艺参数培养基的初始pH值为7.22,初始含水量为75.78%,C/N为0.22,此时纤溶酶活性可达1.2653TAME单位/mL。试验采用生理盐水浸提发酵培养基,于4℃冰箱浸提24h后,6000r/min冷冻离心20min除杂质,得到粗酶液。粗酶液经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后,获得了纤溶酶单一组分,表观分子量为30,000Da,最终纯化倍数达9.49,回收率为17.08%,纤溶酶比活达到47.83。初步研究了双曲霉产纤溶酶的一些性质,酶的最适反应温度为40℃,在25℃以下,酶活性可以保持在90%以上。最适pH值为9.0,pH值在6.0～9.0之间时,纤溶酶活性保持在80%之上。K+和Ca2+对酶活有激活作用,而Cu2+和Mn2+对酶活性起抑制作用。双曲霉纤溶酶不仅能直接降解纤维蛋白,还能使纤溶酶原激活转化成纤溶酶,间接降解纤维蛋白。纤溶酶活性受到苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制,乙二胺四乙酸(EDTA)和β-巯基乙醇(β-ME)对其酶活性没有影响,由此可以看出双曲霉纤溶酶的活性中心含有丝氨酸。本课题对米曲霉、黑曲霉混合发酵产纤溶酶的发酵及培养条件、双曲霉纤溶酶的分离纯化及双曲霉纤溶酶酶学性质进行了比较系统的研究。目前关于混菌发酵产酶的分离纯化的研究还相当少,一般是基于筛选相容的菌株,然后进行不同混合条件下产酶能力的检测,关于其机制等方面的研究尚没有相关报道。本文为寻找天然纤溶酶及进一步研制开发新型溶栓剂提供了重要的理论基础。