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几丁寡糖（chitooligosaccharides,CHOS）因其具有良好的水溶性、抗氧化性和抗菌性能,广泛应用于化妆品、医药、食品和农药等领域。甲壳素酶能水解甲壳素结构中的β-1,4糖苷键,生成CHOS。与传统的化学法降解甲壳素相比,酶法具有反应温和、产物纯度高、无环境污染等优点,目前已成为生产CHOS的重要方法。然而,野生菌产的甲壳素酶催化效率低限制了其生产和应用。本研究以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600作为表达宿主菌,选择来源于芽孢杆菌属Bacillus sp.DAU101的甲壳素酶基因（chisb）构建表达载体。通过对表达载体中表达元件进行优化,并利用分子对接、定点突变以及易错PCR等手段,提高了甲壳素酶Chisb的表达水平及催化效率,使催化合成的CHOS产量和底物转化率进一步提高;同时,探究了原始酶及其突变体的酶学性质。主要研究内容及结论如下:（1）构建了含有Bacillus sp.DAU101甲壳素酶编码基因chisb的重组表达质粒,并成功在B.subtilis WB600中实现了异源表达。（2）对表达载体pP43NMKchisb-sp-his中表达元件进行了优化。通过信号肽筛选、核糖体结合位点（RBS）优化、启动子替换以及N端融合短肽等手段,最终将甲壳素酶Chisb的酶活提高到58 U?mL-1。（3）对Chisb催化结构域中保守区域（DXDXE）的氨基酸进行定点突变,证实了D193、D195和E197位的氨基酸在Chisb催化结构域中的重要作用。利用同源模拟构建Chisb的三维蛋白结构模型,并使用Discovery Studio（DS）软件将几丁五糖（GlcNAc）5与Chisb进行分子对接。通过定点突变,筛选得到唯一的正向突变体F273W,比酶活达到249.62U?mg-1,比原始酶提高了1.45倍。为进一步提高Chisb的催化效率,采用易错PCR和高通量筛选技术对Chisb进行定向进化研究,最终获得了两个正向突变体（C43D和E336R）,其比酶活分别为264 U?mg-1和280 U?mg-1,是原始酶的1.53倍和1.62倍。（4）高效液相色谱分析水解产物为N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、几丁二糖（GlcNAc）2、几丁三糖（GlcNAc）3和几丁五糖（GlcNAc）5。突变体C43D、E336R和F273W催化生成的CHOS产量分别为2.06 g?L-1、2.53 g?L-1和2.02 g?L-1,相比对照分别提高了2.31倍、2.84倍和2.27倍;除此之外,底物转化率分别为68.7%、84.3%和67.3%,相比对照分别提高了39%、54.6%和37.6%。（5）对酶学性质进行研究,确定了原始酶的最适温度为60oC,最适pH为5.0;突变体C43D和E336R的最适温度为55oC,F273W为60oC;C43D和F273W的最适pH为5.0,E336R为9.0。原始酶对胶体甲壳素和不同聚合度的CHOS亲和力较强;且向反应体系中添加Mn2+可以显著提高原始酶及其突变体的酶活;对原始酶及其突变体的动力学参数进行测定发现,相比原始酶,突变体的底物亲和力和催化效率都显著提高。