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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)致全世界近1/3的人受到感染,每年新发结核病人达800万,200万人死于结核病。到目前为止,被研究证实的MTB致病因子并不多。其中,肝素结合血凝素蛋白(heparin-binding hemagglutinin adhesin HBHA)是近年来研究发现的MTB重要致病因子之一。HBHA蛋白是一个28-kD的细菌表面粘附素,它具有诱导MTB粘附非巨噬细胞,介导MTB肺外播散等多种生物学活性。但是HBHA蛋白在MTB感染过程中的具体作用还有待于进一步的探讨。本课题克隆表达并提取了天然HBHA蛋白,初步研究了该蛋白在MTB与上皮细胞相互作用中的功能。1、结核分枝杆菌HBHA基因的克隆表达及蛋白的纯化在GenBank中检索出HBHA基因的DNA序列,用引物设计软件Primer Premier 5.0设计含BamHⅠ和HindIII酶切位点的特异性引物。以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出600bp目的基因。将目的基因克隆入克隆表达载体pQE-80L,测序结果Blast比对正确后,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳证实成功表达了28-kD目的蛋白。将诱导后的重组菌体超声裂解后,分别取上清和沉淀做SDS-PAGE电泳,发现表达的蛋白以可溶性形式存在。随后用His Gravitrap亲和层析柱纯化可溶性蛋白,获得重组HBHA蛋白(rHBHA)的浓度为10.98mg/mL,分装后保存于-20℃备用。并以此免疫新西兰兔制备抗rHBHA蛋白的多克隆抗体。2、天然HBHA蛋白提取以及HBHA蛋白部分生物活性观察用7H9液体培养基培养卡介苗(BCG)至稳定生长期,离心收集BCG菌体,用PBS重悬菌体,冰浴条件下超声裂解。离心并留取上清。将上清通过已用PBS平衡的Heparin Sepharose CL-6B柱子,用不同NaCl盐离子浓度梯度的PBS将天然HBHA洗脱,收集各浓度梯度洗脱蛋白。取少量样品进行SDS-PAGE电泳,并用Western blot鉴定,证实得到天然HBHA蛋白(nHBHA)。将获得的nHBHA分装后保存于-20℃备用。分别用不同浓度的rHBHA和nHBHA加入到培养BCG的7H9液体培养基中,36小时后观察其诱导BCG聚集情况。同时,将HBHA蛋白与抗HBHA抗体以最适比例37℃孵育一小时后,再将孵育过的蛋白加入到BCG培养基中,36小时观察抗体对不同浓度nHBHA和rHBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果显示所得天然和重组蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并且天然HBHA诱导聚集能力强于重组HBHA蛋白,此种凝集均可被抗rHBHA多克隆抗体抑制。3、HBHA蛋白在MTB与上皮细胞相互作用中的功能机制研究分别用不同浓度的rHBHA和nHBHA作用于饥饿诱导后的A-549细胞,通过Western blot和RT-PCR技术检测细胞自噬相关分子LC3在蛋白水平和基因水平的变化。结果显示随着HBHA蛋白浓度的增高,A-549细胞内LC3表达无论在基因还是在蛋白水平都呈现逐渐减低趋势。且rHBHA和nHBHA组均有此趋势。这一结果首次提示HBHA蛋白具有抑制上皮细胞自噬的作用,是结核分枝杆菌感染与播散的机制之一。