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人脐血富含造血干／祖细胞，是骨髓与外周血以外的另一种有广阔应用前景的造血细胞来源。近年，脐血移植已广泛地用于治疗儿童白血病和恶性肿瘤等。然而，由于单份脐血的采集量有限，其中所含造血干／祖细胞数量难以满足大龄儿童及成人患者的需要。造血干细胞体外扩增技术有望克服这一障碍。脐血造血干／祖细胞有很强的增殖分化能力，在造血细胞因子的刺激下可大量增殖，但在扩增同时造血干／祖细胞也不可避免地分化成熟，从而影响了其自我更新能力和多向分化潜能的保留。因此，如何能既扩增造血细胞数量又尽可能保留造血细胞性能则是当前研究的重点。近年，在细胞因子组合方案方面进行了大量研究，仍未建立一条确切有效的途径，而对于细胞周期调控的研究甚少，但作为机体细胞，造血干细胞增殖分化的根本仍是细胞周期的演进，造血干细胞增殖分化进程不但受控于细胞因子，同时与细胞周期调控因子密切相关。 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是重要的细胞周期调控蛋白，能促使细胞由Gl期进入S期。本研究采用流式细胞仪技术对不同培养时间和不同培养条件下脐血CD34~+细胞中PCNA的表达水平和细胞周期进行了测定，揭示PCNA在造血调控中的重要生物学意义，为进一步研究如何通过调控PCNA来控制造血干细胞的增殖和分化提供一定的研究基础。 1．脐血CD34~+细胞在体外扩增中PCNA表达水平的变化 采用Mini MACS(magnetic activated cell sorting)分离获得CD34~+细胞，汕头大学医学院硕士学位论文培养于含有不同细胞因子组合的IMDM(Iseove，5 modified Dulbeeeo，smedium，IMDM)培养体系中。实验分组:①无细胞因子组即空白对照组;②干细胞因子(stem eell faetor，SCF)+白细胞介素6(IL一6)+白细胞介素3(xL一3)组;③SCF+xL一6+IL一3+IfII小板生成素(Thrombopoietin，Tpo)组;④Flt3一配基(Flt3一ligand，FL)+Tpo+SCF+IL一6+IL一3组。在培养的第3天、5天、7天收集细胞，流式细胞仪检测PCNA表达水平。结果发现，新鲜分离的脐血中CD3旷细胞低表达PcNA，阳性率为(H .6士5 .2)%，在体外短期培养，无细胞因子的组合PCNA表达水平逐渐下降，而在含有各细胞因子组合的培养体系中，PCNA表达水平逐渐增高，其中以FL+TPo+scF+IL一6+IL一3组合作用最显著。2.脐血CD34+细胞在体外扩增中细胞周期的变化。 采用Mini MACS分离获得CD34+细胞，在含有不同细胞因子组合(①seF+IL一6+IL一3组;②SCF+IL一6+IL一3+Tpo组;③FL+Tpo+sCF+IL一6+IL一3 组)的培养体系中培养7天，在0天、3天、7天收集细胞，碘化丙陡(propidium iodide，PI)染色后运用流式细胞仪检测细胞周期。结果发现，新鲜分离的 脐血CD34+细胞95 .1%处于G 0/ Gl期，仅4.9%处于S期，在不同细胞因子 组合下培养3天后，细胞增殖分化进入增殖期，第7天S/GZ/M期比例明 显增多。 以上研究结果表明，脐血CD34十造血干/祖细胞在造血生长因子作用下，PCNA蛋白的表达明显增高，从而促使细胞由静止期进入增殖期进行增殖。