目前，全世界有3.5～4亿人为慢性乙肝病毒携带者，其中九千万人发展成继发性肝病。由于HBV感染及其继发病而死亡的患者每年约1～2百万。我国是HBV感染的高发区，约1.7亿人受HBV感染，一千七百万人患慢性肝炎。每年死于HBV导致的肝癌，肝硬化者约五十万人。注射乙肝疫苗是预防乙型肝炎的重要手段。采用乙肝疫苗来预防乙型肝炎，经过多年广泛应用以被证明是一种安全、可靠、有效的方法。世界卫生组织（WHO）推荐在乙型肝炎高度流行的国家给婴幼儿常规免疫接种。目前我国已将接种乙肝疫苗纳入国家计划免疫体系。我国，由中国预防医学科学院病毒所和长春生物制品研究所共同研制的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达的乙肝表面抗原S蛋白于1992年批量上市。利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。长春生物制品所目前生产所用细胞株构建于二十世纪八十年代末，产量在1~2 mg HBsAg/48 hr/L，产品供不应求。为了扩大市场份额，向社会提供更多的优质的乙肝疫苗，我们打算构建新的CHO工程细胞株，使其HBsAg表达量在现有水平上得到提高。我们对目前长春生物制品所使用的乙肝疫苗生产细胞株C28的特点进行仔细研究，在查阅大量文献的基础上提出全新的表达载体设计方案，包括更换启动子、引入内含子、去除目的基因的5′和3′非翻译区、弱化抗性标记基因、改造目的基因中的稀有密码子等，构建了乙型肝炎病毒表面抗原S基因的两种新型表达载体。启动子是影响外源基因表达效率的关键因素之一。我们构建的1号和3号两种表达载体是以pCI和pCIneo质粒为出发质粒。pCI和pCIneo都带有hCMV启动子，此启动子比pSV中的SV40早期启动子要强5倍。 <WP=69>表达载体中引入天然或人工合成的内含子序列有利于引导外源蛋白前体的稳定性，我们选择的pCI和pCIneo表达载体中，紧接hCMV下游有一IVS序列，有利于目的基因mRNA的成熟与稳定。在目的基因5′非翻译区（UTR），有可能形成一定的二级结构，从而影响目的基因的翻译起始，而3′非翻译区则可能存在降低mRNA稳定性，影响mRNA寿命的区域，从而影响外源基因的表达。所以我们构建1号和3号表达载体时，去除目的基因的5′和3′非翻译区。对dhfr的弱化可以大大提高共扩增基因的拷贝数，而对neo的弱化可促使筛选到整合于染色体热点上的转化子。1号表达载体通过去除SV40早期启动子中的增强子而弱化dhfr基因的表达；3号表达载体在弱化dhfr基因表达的同时，又增添了一种新的选择标记，即neo。采用去除SV40早期启动子中的增强子来弱化启动子强度，从而达到弱化neo基因表达的目的。稀有密码子在真核细胞中对翻译有一定的影响，在真核生物中有两个最稀有密码子TTA和TCG，当几个这种稀有密码子相距较近时会严重阻碍核糖体的前进，使翻译效率大大降低，表达水平下降。在本课题中，通过对乙肝表面抗原S基因密码子使用情况的分析表明，在213，216位氨基酸处分别存在一个使用频率最低的密码子TTA，二者只相距6个核苷酸。我们预计，这两个相距较近的密码子可能会对翻译过程造成很大的影响，从而降低蛋白表达量。因此，我们用哺乳动物细胞最常用密码子CTG来取代TTA，同时将224位稀有密码子GTA突变成GTG得到Sm基因。用PCR方法从长春生物制品研究所基因工程乙肝疫苗生产用工程细胞C28中分离和扩增HBsAg S基因片段，采用重叠PCR技术将第213，216和224位氨基酸的三个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子，得到Sm。以C28基因组DNA为模板，扩增出570bp的dhfr基因和930bp的SV弱<WP=70>+dhfr基因，其中后者含有SV40早期启动子序列和dhfr基因序列。以pCIneo为模板，扩增出1140bp的SV弱+neo基因，它含有SV40早期启动子序列和完整的新霉素磷酸转移酶基因序列。把Sm基因、dhfr、SV弱+dhfr、SV弱+neo分别克隆到pCI和pCIneo载体上，构建成两种表达载体。两种表达载体经PCR方法和酶切方法证明构建正确。序列分析表明所构建的表达载体插入的外源基因型为我国乙型肝炎病毒主要流行株adr亚型的S基因，对该基因稀有密码子的改造结果也与预期相符；载体上其他表达元件也经测序证实。将两种质粒载体经大提和氯化铯密度梯度离心纯化后转染CHO-dhfr-细胞，在CHO-dhfr-细胞中成功表达出HBsAg。利用DIAGNOSTIC KIT for HBsAg检测HBsAg的表达量。在dhfr基因与目的基因共转化的细胞中，随着培养基中MTX浓度的增加，dhfr基因与外源基因均明显扩增。将1号、3号两种表达载体成功转染到CHO-dhfr-细胞后，1号转染的细胞一直使用MTX筛选培养基,并逐渐增加MTX的浓度，使S基因拷贝数不断增加；3号转染的细胞我们首先使用G418使3号表达载体尽可能整合到染色体的热点部位。然后我们用MTX代替G418筛选培养基，并逐渐加大MTX的浓度，使S基因得到扩增。经不同加压筛选策略获得抗性细胞群，进一步用单克隆培养筛选出了几株高效表达HBsAg的细胞株，为提高重组CHO乙型肝炎疫苗的产量奠定了基础。