【摘 要】
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该研究首先从牛十二指肠组织中提取总RNA,用RT-PCR法克隆牛肠激酶活性亚基的cDNA,使其与ThiHisA载体连接,转入大肠杆菌中扩增,经过DNA序列测定,与基因库中肠激酶活性亚基的序
【出 处】
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中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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该研究首先从牛十二指肠组织中提取总RNA,用RT-PCR法克隆牛肠激酶活性亚基的cDNA,使其与ThiHisA载体连接,转入大肠杆菌中扩增,经过DNA序列测定,与基因库中肠激酶活性亚基的序列完全一致.然后把得到的目的基因与pPIC9K质粒相连,转入Pichiapastoris酵母中,用G418筛选出高拷贝的菌株,经过发酵罐发酵培养,甲醇诱导47小时后表达量达到最高,发酵液经过高速离心后去除细胞碎片和大分子杂蛋白,再用5K和50K的滤膜超滤膜去除大小分子的杂质并浓缩,同时在超滤液中加入巯基乙醇使酶变性,最后经过离子交换和亲和层析纯化获得肠激酶纯品,其纯度在90﹪以上并且每升发酵液能得到700OU的肠激酶,研究结果表明,经过基因克隆、表达及纯化获得的重组肠激酶产率及纯度高、活性好,工艺稳定、技术先进,为进一步扩大生产规模提供了实验依据,打下了良好基础.同时,为基因工程产品开发提供了有用的工具酶,具有一定的基础理论意义和实际应用价值.
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