研究背景小肠对射线有很高的敏感性,高剂量的电离辐射可以抑制肠上皮细胞增殖,细胞出现凋亡和变性坏死,破坏肠道上皮的完整性,增加肠上皮细胞和肠道内病原微生物的接触,产生严重的肠道炎症反应。深入研究辐射引起的放射性肠损伤,为当前肠型放射病预防和临床腹腔放疗防护提供新思路。细胞焦亡是一种由Caspase介导的细胞程序性死亡方式。细胞内感受体接收危险信号后,组成炎症小体,募集并切割pro-Caspase-1前体,释放活化状态的Caspase-1执行下游程序,切割焦亡执行蛋白。焦亡蛋白均为Gasdermin家族蛋白,包含有一个N端结构域和C端结构域,在非激活状态下,C端蛋白能够抑制N端蛋白的打孔功能。Gasdermin-D（GSDMD）的N端蛋白具有细胞膜打孔的功能,全长蛋白的铰链区域被活化的Caspase切割后,N端蛋白和C端蛋白的自抑制被打开,N端蛋白在细胞膜上寡聚打孔引起细胞焦亡。焦亡细胞会呈现一系列形态变化,包括细胞膜通透性改变、细胞内容物释放、细胞外部水分透过细胞膜上的孔道大量进入细胞,最终导致细胞胀裂引发机体炎症反应。临床上使用的化疗药物通常通过激活肿瘤细胞凋亡通路,使用过程中会产生严重的副作用,限制了化疗药物的使用。长期以来,凋亡一直被认为是细胞毒药物杀死癌细胞的一种机制。近期研究证明,焦亡也能抑制肿瘤细胞增殖。细胞凋亡和焦亡都是Caspase依赖的程序性细胞死亡途径,Caspase-3是细胞凋亡和焦亡途径中共同的关键作用蛋白,肿瘤抑制基因GSDME被激活后其表达水平决定了肿瘤细胞死亡方式,GSDME高表达细胞受到外界刺激后发生焦亡,而GSDME低表达时细胞发生凋亡。研究发现,GSDME也可以位于Caspase-3的上游,连接外在和内在的凋亡途径,促进Caspase-3的激活,放大炎症反应。GSDME介导的焦亡与化疗和抗肿瘤免疫的副作用有关。放疗过程同样也伴随着大量正常细胞的死亡,经大剂量电离辐射后小鼠肠道细胞出现凋亡、自噬和坏死,小鼠短期内快速死亡,给予凋亡、自噬、坏死抑制剂没有显著的防护作用,发现多种细胞焦亡机制参与辐射诱导肠损伤调节。有关炎症小体介导的细胞焦亡如何参与辐射肠损伤的分子机制目前所知不多,肠细胞焦亡与其它死亡方式如细胞凋亡和自噬等的关系,也需要进一步研究。研究目的目前对辐射引发的肠道细胞死亡及组织损伤缺乏有效的治疗方法,研究发现电离辐射能够诱导明显的GSDME的激活和细胞焦亡现象,基于GSDME表达的复杂基因调控网络进行的研究目前还不广泛。越来越多的证据表明,ce RNA竞争性地与mi RNA结合,调节mi RNA或m RNA的表达,在细胞发育和疾病中起关键作用。本课题主要是对电离辐射诱导肠道细胞生理功能变化,从ce RNA网络探究GSDME与细胞焦亡,阐明细胞焦亡在电离辐射诱导肠上皮损伤及辐射防护作用及分子机制。研究内容1.体外培养人肠上皮和结肠癌细胞,经不同剂量照射后,通过检测焦亡指标,研究细胞焦亡参与肠上皮细胞辐射损伤调节的分子机制;2.通过mi RDB、Target Scan、mi RWalk、micro RNA.org等网站预测与焦亡蛋白GSDME相关的mi RNA,选择出可信度高的结果,应用RT-PCR、报告基因实验确认其中对GSDME有调控作用的mi RNA,系统研究mi RNA调控GSDME表达在辐射诱导肠损伤中的作用和分子机制;3.构建辐射诱导焦亡相关的ce RNA网络研究,文献查找与mi RNA相关的长链非编码RNA,确定其与电离辐射具有明显的效应关系,干涉长链非编码RNA,检测GSDME基因表达变化情况;4.过表达GSDME过表达或抑制长链非编码RNA,对电离辐射后细胞形态和功能进行研究;5.研究ce RNA在辐射诱导的细胞焦亡中的作用机制。研究结果1.电离辐射诱导肠上皮细胞焦亡;2.GSDME蛋白在辐射诱导的肠道焦亡过程其关键作用;3.miR-448在电离辐射肠细胞中,特异性靶向GSDME基因,抑制其表达;4.NEAT1-miR-448-GSDME调控轴在辐射诱导肠细胞焦亡过程起重要作用。结论本课题研究发现,电离辐射诱导肠上皮细胞发生由蛋白GSDME介导的细胞焦亡。mi R-448特异性靶向GSDME m RNA,通过结合3’-UTR抑制其表达。lnc RNA NEAT1通过竞争性结合mi R-448,构成ce RNA调控轴,进而调控GSDME表达。