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背景表皮细胞生理行为对于皮肤创伤后再上皮化和组织结构的重塑具有重要作用。然而,其作用的调控机制及其影响因素未完全阐明。因此,阐明表皮细胞增殖、分化和有丝分裂调控的影响因素及其相关分子机制,有利于引导皮肤创伤后创面组织的有序修复,或为形成结构和功能兼备的皮肤组织替代物提供理论基础,从而最终实现无延迟、无瘢痕的完美修复。材料和方法1.收集临床手术中的正常皮肤组织(Normal)7例、创面组织(Wound edge)8例和瘢痕组织(Scar)7例,通过HE、Masson和六胺银染色比较其组织形态学差异。采用免疫荧光染色检测基底膜成份Ⅳ型胶原(Collagen IV)、层粘连蛋白(Laminin)和Laminin-5及其受体整合素(Integrin-β4)的表达分布差异,同时检测CK10、CK14、 CK5、CK19和Integrin-β1的表达以明确三种组织内表皮细胞分化谱系的差异。2.使用Ca2+刺激原代人表皮角质形成细胞(Human epidermal keratinocyte, HEK)和人永生化表皮细胞(Human immortalized keratinocyte, HaCaT)构建表皮细胞分化的体外模型。体外采用MaxGelTM ECM模拟表皮基底膜,通过免疫荧光和Westernb1ot检测Integrin-β4表达情况,并通过Real-time qPCR和Western blot检测CK10、CK14和CK19的表达水平,明确其对IEK和HaCaT细胞增殖和分化行为的影响。3.采用激光共聚焦断层扫描结合三维组织结构重建技术,比较Normal、Wounde edge和Scar组织中细胞极性蛋白分子姗的表达分布情况,并通过Pericentrin知Survivin分别标记中心粒(Centrosome)和中心颗粒体(Spindle midbody),从两种途径来分析三种组织内表皮细胞的有丝分裂方向差异。4.采用免疫荧光染色检测PAR3和Integrin-β4在Nornal、Wounde edge知Scar组织表达分布关系,同时检测三种组织内真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblast,HDF)标记分子α-S№的表达分布情况。体外使用MaxGelTM ECM模拟袁皮基底膜,同时联合HDF细胞培养上清液,借助激光共聚焦断层扫描结合三维组织结构重建技术分析二者对HEK和HaCaT细胞内PAR3和Integrin-β4空间表达分布的影响,并通过Real-time qPCR和Western blot检测二者对HEK和HaCaT细胞内PAR3.Integrin-β4表达水平的影响,从而探索表皮细胞有丝分裂方向调控的分子机制。此外,采用Micro-contact printing结合Time-lapse相差显微镜实时观察分析细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和HDF细胞对HEK细胞有丝分裂方向的调控作用。结果1.创伤修复中的NormalβWound edge和Scar组织形态结构及表皮细胞分化谱系均存在明显差异。相对于Normal组织,Wound edge组织表皮细胞呈明显增殖状态,而Scar组织基底膜结构异常,且袁皮细胞呈高分化状态。这提示,基底膜可能影响表皮细胞的分化谱系,进而干预创伤修复的结局。2.体外使用MaxGelTM ECM模拟表皮基底膜可以增强HEK和HaCaT细胞内Integrin-β4的表达水平,抑制Ca2+刺激引起的HEK和HaCaT细胞分化。这表明,基底膜能够通过与表皮细胞的黏附活动,调控其增殖和分化行为。3.表皮细胞极性蛋白分子PAR3 在Normal.Wound edge和Scar组织表达分布不同,且表皮细胞的有丝分裂方向存在明显差异,表现为其在Normal和Woundedge组织呈有序分裂,而在Scar组织成无序的紊乱分裂。这提示,创伤修复过程中,表皮细胞有丝分裂方向与修复结局密切相关,其可能受基底膜黏附作用的影响。4.PAR3 和Integrin-β4在Normal.Wounde edge和Scar组织均呈共定位表达分布。其中,Scar组织基底膜处PAR3 和Integrin-β4表达分布异常,同时其基底膜侧a-SMA表达阳性的HDF细胞数量减少,提示创伤修复早期区域性的瑚DF细胞缺失可能与基底膜修复异常有关。体外使用MaxGelTM ECM模拟表皮基底膜,同时联合HDF细胞培养上清液,均可以影响PAR3 和Integrin-β4在HEK和HaCaT细胞空间表达分布和表达水平,其作用机制可能有涉及到ERK通路。此外,体外HDF细胞培养上清液可以影响ECM与HEK细胞黏附作用,调控HEK有丝分裂的方向。这表明,基底膜可以通过与表皮细胞的黏附活动,调控其有丝分裂的方向,这在皮肤创伤修复具有重要作用。结论皮肤创伤修复过程中,基底膜可以通过其与表皮细胞的黏附作用,影响表皮细胞生活的外界微环境,调控表皮细胞的增殖、分化及有丝分裂方向等细胞行为,从而干预创伤后再上皮化和上皮组织结构重塑。而创伤修复早期,HDF细胞的缺失可能是基底膜异常形成的细胞学基础之一。因此,探索基底膜形成的影响因素,及其对表皮细胞行为的调控作用和相关机制,可以为实现完美的皮肤创伤修复提供理论依据。