论文部分内容阅读
目的本实验将本课题组构建的单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu转染到体外诱导培养的兔骨髓源性内皮祖细胞后，再移植到造模的兔股骨头缺血坏死局部,然后检测其促进坏死区局部成血管和成骨能力。方法1.密度梯度离心法获取兔骨髓单个核细胞。2.用M199培养基诱导培养骨髓单个核细胞为内皮祖细胞。3.通过培养的细胞集落形成的形态、细胞特殊表面标记、细胞特殊摄取能力三方面鉴定内皮祖细胞。4.以最佳转染指数转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu到内皮祖细胞。5.兔缺血性股骨头坏死的动物模型的制作(激素型)。6.实验分组，共三组,每组实验动物均为6只。A组即实验组:移植转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu的内皮祖细胞悬液; B组即对照组:移植内皮祖细胞悬液组; C组即空白组:只是加入重悬细胞的完全培养液。7.制备需要移植的细胞悬液及将转染的内皮祖细胞植入兔缺血性坏死动物模型局部。8.指标检测（1）.动物模型检测：X线摄片检查及组织切片HE染色检查造模是否成功（2）.免疫组织化学染色检测BMP-2表达（3）.坏死区血管形成情况检测：CD34免疫组织化学检查及墨汁灌注透明切片血管形态学观察及血管面积定量图像分析（4）.组织学检测移植后股骨头坏死情况9. SPSS17.0统计软件进行数据的分析。结果1.内皮祖细胞的鉴定(1)细胞形态诱导培养的MNCs48h后出现贴壁生长的现象。第5-6天，贴壁生长的细胞形态变成梭行的形状,第9-10天细胞的形态由梭型变化为多角形，然后细胞间开始逐渐融合成片，第15-16天细胞集落表现出出典型的“铺路石”形态。(2)内皮祖细胞表面特异标记检测经流式细胞仪分析后，检测内皮祖细胞表面特异标记CD34、CD133、VEGFR-2阳性率分别为(56.61±6.24)%、(49.36±5.16)%和(54.70±4.28)%(3)内皮祖细胞结合能力检测荧光显微镜下观察，出现双荧光的细胞（EPCs）数目约占总细胞数的50%左右。2.病毒液转染效果观察倒置荧光显微镜观察示,在MOI值为200时转染的效果, A组的细胞未见明显的细胞病变，说明转染已经成功。3.动物模型结果指标检测X线检查结果显示,造模6后，股骨头处出现低密度影像变化，证明造模已经成功。移植6后组织学检查显示成骨细胞等组织细胞变少,骨小梁变细、断裂，骨小梁破坏严重，出现大量骨空凹陷。4.免疫组织化学染色检测细胞BMP-2表达情况倒置相差显微镜观察示，A组转染细胞阳性表达BMP-2阳性细胞数为(13±1.41), B组不表达BMP-2阳性细胞数。5.新生血管检测结果CD34免疫组织化学结果显示每200倍个视野，移植后2w、4w、8w， A组与B组、C组之间统计学比较p<0.01，均具有统计学意义；移植后2w，B组与C组之间统计学比较p<0.05，移植后第4w、8w，B组与C组之间统计学比较p<0.01，均具有统计学意义。经血管墨汁灌注透明切片形态学检测显示：A组有大量的血管生成，B组有少量血管生成，C组未见明显血管生成。墨汁灌注血管面积图像分析法测定灌注血管面积结果显示：在移植后2w、4w、8w，A组与B组、C组之间比较p<0.01，均具有统计学意义；在移植后的个时间段检测，B组与C组之间统计学比较p<0.01，均具有统计学意义。6．组织学检测移植后股骨头坏死修复情况移植6周后，组织切片HE染色检测显示：A组可见新生骨小梁,毛细血管及成骨细胞等细胞成分，骨小梁连续，骨空凹陷明显减少；B组可有血管新生,成骨细胞等组织细胞较少,骨小梁仍然有部分断裂现象，骨空凹陷较实验组较多， C组可见骨小梁断裂、变细，骨空凹陷较多，未见新生骨小梁及血管等组织，与移植前比较未见明显变化。结论1.可以通过兔骨髓诱导培养单个核细胞为内皮祖细胞。2.内皮祖细胞具有成血管的能力。3.移植转染Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu的内皮祖细胞具有较强的成血管及成骨能力。