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背景急性心肌梗死是世界范围内常见的急危重症,临床常见的治疗方法为通过药物或手术实现血管再通,然而心肌缺血后恢复血流可引起再灌注损伤,是影响治疗效果及预后的重要因素。缺血再灌注损伤的发生机制还不十分明确,现有理论包括再灌注导致细胞内氧自由基(ROS)的大量产生、局部炎症作用造成的细胞损伤。在动物实验中降低ROS产生、减轻局部炎症反应、增加血红色加氧酶-1(HO-1)表达或者通过缺血预处理使细胞产生应激反应可以降低再灌注损伤。但是目前临床上还没有可以使用的降低缺血再灌注损伤的特效药物,因此研究缺血再灌注损伤的发生机理,开发新的治疗策略具有重要的理论意义和临床价值。文献报道亚砷酸钠可以诱导HO-1的表达和细胞应激反应,于是我们猜想亚砷酸钠可能对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。本课题拟通过实验探讨亚砷酸钠对心肌缺血再灌注损伤的作用和机制。目的通过大鼠体内缺血再灌注损伤模型研究亚砷酸钠预处理对心肌的保护作用及对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制。通过体外实验探讨亚砷酸钠对心肌细胞氧自由基产生的影响和对心肌细胞抗氧化损伤的作用;探究亚砷酸钠诱导的细胞应激反应及对血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响;进一步研究亚砷酸钠对NLRP3炎症小体的作用特点。以此探讨亚砷酸钠对心肌缺血再灌注损伤的保护及其作用机制,为缺血再灌注损伤的发生寻找新的防治方法和策略。方法1.建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型,24h后心脏冷冻切片,TTC染色检测心肌梗死面积(Infarctsize)和心肌缺血区(Areaatrisk,AAR),计算心肌梗死面积与心肌缺血区的比值(Infarctsize/AAR),评价亚砷酸钠对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。2.大鼠心脏功能评估。大鼠心肌缺血再灌注恢复24h后,VEVO 2100高分辨率体内超声心动图成像系统在M模式下进行大鼠心脏超声采集,在胸骨旁左心室长轴或短轴视图上测量左心室舒张末期内径和收缩末期内径。计算左心室射血分数(EF%)和左心室短轴缩短率(FS%),所有测量结果为五个连续心动周期的平均值。3.体外缺氧复氧模型评估亚砷酸钠对心肌细胞活性氧(超氧阴离子和过氧化氢)产生的影响。将H9c2细胞在饱和氮气中培养不同时间后恢复正常通气,用细胞色素C和肾上腺素的颜色变化检测超氧阴离子,用二甲基酚橙法检测过氧化氢的含量。4.体外细胞代谢抑制模型评估亚砷酸钠对心肌细胞的存活率的作用。将H9c2细胞进行饥饿及呼吸抑制处理不同时间,恢复正常培养条件,用MTT法检测细胞存活率。5.亚砷酸钠对心肌细胞抗氧化损伤的作用。在不同时间用亚砷酸钠预处理或后处理心肌细胞1h,换液后用过氧化氢处理心肌细胞8h,MTT检测细胞存活率。6.用纯化的线粒体进行体外呼吸实验。分离并纯化大鼠肝脏线粒体,用反应缓冲液重悬并调整线粒体浓度,加入呼吸链复合体Ⅰ或Ⅱ偶联的代谢底物,以及ADP和抑制剂,用极谱法溶氧仪实时测量并记录反应体系的氧浓度。亚砷酸钠在反应前或反应过程中加入,观察其对线粒体呼吸的作用。7.Western Blot检测eIF2α的磷酸化和HO-1的表达,反转录PCR检测胞质应激下游基因GADD34和CHOP的表达变化。8.NLRP3炎症小体活化实验。THP-1细胞先用佛波酯(PMA)诱导分化过夜;分化后的THP-1细胞或原代培养骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)用LPS预处理3h,再用NLRP3炎症小体的不同激活剂如尼日利亚菌素(Nigericin)、ATP等处理30min到1h,收集上清ELISA检测IL-1beta的含量。结果1.大鼠体内心肌缺血再灌注模型实验结果显示,亚砷酸钠预处理可显著降低心肌梗死区与心肌缺血区的比值(P<0.0001),心脏超声结果显示亚砷酸钠增加左心室射血分数和左室短轴缩短率(P<0.01)。股动脉插管测量结果显示实验组和对照组的心率、收缩压和舒张压没有显著改变。2.在体外缺氧复氧模型中亚砷酸钠对心肌细胞活性氧自由基的产生没有显著影响(P>0.05)。3.在体外细胞代谢抑制模型中,亚砷酸钠对H9c2细胞的存活率没有显著影响(P>0.05)。4.亚砷酸钠预处理显著降低了过氧化氢造成的H9c2细胞损伤。5.在体外线粒体呼吸实验中,亚砷酸钠可抑制复合物Ⅰ-底物偶联的线粒体呼吸,对复合物Ⅱ-底物偶联的线粒体呼吸无显著作用。6.亚砷酸钠的短暂处理可诱导eIF-2α的磷酸化及其下游基因GADD34和CHOP的表达;亚砷酸钠可诱导具心血管保护作用的HO-1的表达。7.细胞实验发现,亚砷酸钠可显著抑制NLRP3炎症小体的活化,并且主要抑制炎症小体活化的准备阶段。提示亚砷酸钠对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。结论1.亚砷酸钠可显著降低心肌梗死区与心肌缺血区的比值,增加左心室射血分数和左室短轴缩短率,对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。2.亚砷酸钠预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制包括:降低过氧化氢对细胞的氧化损伤;诱导eIF-2α的磷酸化和血红素加氧酶-1的表达;抑制NLRP3炎症小体的活化。