论文部分内容阅读
研究背景肾癌是人泌尿生殖系统中常见的肿瘤,其较高的致死率危害着人类的健康,其中肾细胞癌最为常见,占成人肾脏恶性肿瘤的80%以上,其发病率仍在逐年上升中。尽管肾癌治疗方法一直在发展,但术后复发和药物耐药等因素影响着肾癌的治疗效果。细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)是细胞合成分泌到胞外,分布在细胞表面或者细胞之间的一些大分子,主要是由纤维胶原和非纤维胶原、弹性纤维和非胶原糖蛋白(如蛋白聚糖、透明质酸)组成。肿瘤发生侵袭和转移时,ECM无疑是机体的第一道屏障。核心蛋白(decroin,DCN)是蛋白聚糖(proteoglycan,PG)的重要成员之一,目前大量研究表明DCN对多种肿瘤具有抑制作用,能够抑制肿瘤细胞生长、促使肿瘤细胞向正常细胞形态转归、调节肿瘤血管生成和减少肿瘤转移。但目前国内外并没有DCN与肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)之间相关性的研究。本研究利用生物信息学对Oncomine数据库数据的挖掘并结合免疫组化研究DCN在肾细胞癌中的表达并分析与临床病理资料的相关性。同时在体外细胞实验以及动物实验中研究DCN在肾细胞癌中发挥的作用及机制。材料方法1、通过公共数据库Oncomine中的数据研究DCN在肾细胞癌中mRNA的表达水平。同时筛选临床多种肾细胞癌病例,免疫组化方法检测DCN蛋白在肾细胞癌中的表达,运用统计学方法进行DCN蛋白表达水平与RCC患者的临床病理特点的相关性分析。2、通过细胞百科全书(CCLE)数据库分析DCNmRNA在人类不同肿瘤细胞系中的表达水平,并重点分析DNCmRNA在肾细胞肾癌细胞系中的表达水平。5-azac处理786-0细胞系和OS-RC-2细胞系,荧光定量PCR方法检测DCN mRNA水平的变化。同时体外构建DCN过表达质粒pEGFP-N1-DCN并转染肾细胞肾癌细胞系,运用MTT方法、流式细胞技术、平板克隆形成及Transwell方法检测DCN蛋白对肾细胞肾癌细胞系增殖、周期及迁移和侵袭的影响。并通过western blot方法检测DCN蛋白对p21蛋白和E-cadherin蛋白表达变化。3、在14只6周龄雄性BALB/c裸鼠中构建786-0细胞系的皮下种植瘤模型。每组7只,每只分别注射每只裸鼠注射2106个细胞,且每隔两天进行观察直至出现肉眼可见皮下瘤后,每5天用游标卡尺测量皮下瘤体最短径(a)和最长径(b),予以记录,最后根据公式计算肿瘤体积(v=a2b/2),统计分析。27天后,将裸鼠麻醉并处死裸鼠,分离皮下瘤,称量组织重量并记录,统计分析。同时行荧光定量PCR和免疫组化检测两组DCN mRNA和蛋白的表达水平。并将皮下瘤组织进行常规H&E染色和Ki67染色。结果1、DCN在肾癌组织中的表达水平低于正常肾组织:通过Oncomine数据库数据挖掘发现在肾癌组织中DCN mRNA表达水平低于正常肾组织。在不同类型的肾细胞癌中,DCN mRNA的表达水平并没有明显的统计学差异。本研究用免疫组化方法检测DCN蛋白在94例肾细胞癌中的表达,发现DCN蛋白在癌组织中主要表达与癌细胞细胞核,癌组织间质中的表达较弱;而在正常肾组织中,DCN蛋白的表达呈现多样化的特点,肾细胞细胞核、细胞浆以及间质中均有表达。DCN在癌细胞细胞核中的表达与正常肾细胞细胞的阳性表达没有明显差异,但是癌组织间质中DCN蛋白的表达明显低于正常肾组织间质。结合临床病理资料统计学分析结果显示,DCN蛋白在肾细胞癌癌组织间质中的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期和病理无统计学上的差异,但与肿瘤的最大径具有统计学差异(P<0.05),在肿瘤最大径较大时(>4cm),癌组织间质中DCN蛋白的表达量显著降低。2、DCN蛋白可抑制肾细胞肾癌细胞系增殖和转移:通过构建pEGFP-N1-DCN质粒并转染肾细胞肾癌细胞系786-0和OS-RC-2后,DCN蛋白在两种细胞系中分别增加了 2.7倍和2.3倍(P<0.05)。MTT检测细胞活力和增殖速率结果显示在786-0细胞系中自24h起,转染pEGFP-Nl-DCN质粒的细胞增殖较转染pEGFP-N1质粒的细胞缓慢,而在OS-RC-2细胞系中自48h起,转染pEGFP-N1-DCN质粒的细胞增殖较转染pEGFP-N1质粒的细胞增殖速率明显减慢。平板克隆形成实验也发现DCN蛋白表达增加后可有效抑制细胞克隆形成能力,在786-0细胞系中,对照组pEGFP-N1质粒组克隆形成数目为93±8,而处理组pEGFP-N1-DCN质粒克隆形成数目为58±3,两组p值为0.03,具有统计学差异。在OS-RC-2细胞系中,对照组pEGFP-N1质粒组克隆形成数目为158±7,而处理组pEGFP-N1-DCN质粒克隆形成数目为68±9,两组P值为0.008,具有统计学差异。PI染色检测细胞周期结果显示在786-0细胞系中,转染pEGFP-N1-DCN质粒的细胞G1期细胞比例较对照组多,而S期细胞比例减少。细胞周期各期两组(pEGFP-N1vs.pEGFP-N1-DCN)细胞比例分别为:G1 期,41.05±1.01vs.44.78±0.28,P=0.037;S期,44.36±1.16vs.39.66±0.76,P=0.04;G2/M期,14.60±2.17 vs.15.57±0.47,P=0.6。由此提示DCN蛋白可能是通过影响细胞周期进程从而抑制细胞增殖。Transwell小室检测DCN蛋白对肾细胞肾癌细胞系迁移和侵袭的影响同样也发现DCN蛋白可有效减少细胞迁移和侵袭能力。在迁移实验中,786-0细胞系pEGFP-N1组vs.pEGFP-N1-DCN组穿过Transwell小室基底膜的滤膜孔到达下室的细胞数为735±63vs.510±28,P=0.045。而OS-RC-2细胞系两组细胞数分别为 805±77vs.502±28,P=0.035。在侵袭实验中,786-0 细胞系 pEGFP-N1 组 vs.pEGFP-N1-DCN组穿过小室底部基质胶和基底膜滤膜孔到达下室的细胞数为546±19 vs.436±30,P=0.049。而OS-RC-2细胞系两组细胞数分别为675±21 vs.266±17,P=0.002。Western blot方法检测DCN蛋白可能调控的蛋白分子,结果显示DCN蛋白表达增加后,肾细胞肾癌细胞系中p21蛋白分子和E-cadherin蛋白分子都呈上调趋势,提示DCN蛋白可能是通过调控p21和E-cadherin从而调节肾细胞肾癌细胞系增殖和迁移及侵袭能力。3、DCN蛋白可抑制肾细胞肾癌细胞系体内成瘤和瘤体生长:相比于转染pEGFP-N1组,转染pEGFP-N1-DCN质粒后裸鼠皮下瘤成瘤率降低,瘤体体积减少,质量减轻。荧光定量PCR和免疫组化技术检测DCN表达水平发现转染pEGFP-N1-DCN质粒后DCN mRNA和蛋白水平表达都升高。Ki67染色显示相比于对照组,DCN过表达组的Ki67染色阳性率显著降低。结论与意义1、首次明确DCN mRNA肾癌癌组织中的表达低于正常,而DCN蛋白在肾癌癌组织间质中的表达明显低于正常肾组织间质,并且与肿瘤大小相关。2、首次在肾细胞肾癌细胞系中明确DCN蛋白通过调控p21蛋白和E-cadherin蛋白表达从而抑制肾细胞肾癌细胞系增殖和转移:通过MTT、平板克隆形成、流式技术检测转染pEGFP-N1-DCN后细胞增殖能力较对照组显著降低,而Transwell方法检测pEGFP-N1-DCN后细胞迁移和侵袭能力也明显受抑制。Western blot方法检测p21蛋白和E-cadherin蛋白分子在DCN表达增加后表达上调,由此提示DCN蛋白通过调控p21蛋白和E-cadherin蛋白表达从而抑制肾细胞肾癌细胞系增殖和转移。3、在活体动物水平明确DCN蛋白具有抑制肾细胞肾癌细胞系体内成瘤及瘤体生长的作用:DCN蛋白表达增加后能有效降低裸鼠皮下成瘤率,抑制皮下瘤生长,降低皮下瘤瘤体结节大小及Ki67阳性率。这是首次在活体动物水平证实DCN蛋白具有抑制肾细胞肾癌细胞系体内成瘤及瘤体生长的作用。