目的:全球有1/3的人口被结核分枝杆菌(MTB)感染,但只有l0%左右的感染者发生结核病,而绝大多数是以潜伏持留感染形式存在。持留状态的结核菌是产生结核菌潜伏感染、内燃复发、长期治疗、耐药性结核等一系列问题的根本原因,当机体免疫力降低时结核持留菌又开始生长繁殖,导致活动性结核病成为人类健康的主要威胁之一。因此,研究MTB进入代谢或休眠持留期和在持留状态下存活的机制,进而寻找抑制其进入持留期和杀灭结核持留菌的方法,对于控制和根除结核病具有重要意义。现目前关于结核持留方面的研究有很多,主要围绕MTB与宿主巨噬细胞相互作用方面的研究,但是至今我们还是没有得到最明确的MTB持留生存的机制,这也是至今为什么未找到治疗结核菌持留感染的方法的关键所在。MTB基因者组全序列的阐明及分子生物学技术的发展为阐明MTB持留现象的分子机制提供了有效的手段,研究发现MTB进入巨噬细胞后存在特殊的基因表达以适应胞内环境,但是确定哪些或者哪一个特定基因从本质上调控了MTB持留性,有待进一步的研究证实。平板菌落计数法是检测判断细菌活力的常用方法,但是这种方法操作繁杂,况且分枝杆菌生长缓慢(MTB生长周期为4-8周,耻垢分枝杆菌也要3-4 d),不能满足科研工作的时效性。流式细胞仪与FDA染色法相结合检测胞内分枝杆菌,不仅操作简单,而且能在24 h内得出结果,对提高分枝杆菌药敏实验研究及结核病的预防和诊断具有重要意义我们研究的是:选择致病性H37Rv菌株的eis基因,定向克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,利用电穿孔方法将其导入M.S mc~2155中,筛选稳定表达的重组菌株;选择流式细胞仪,利用构建成功的重组M.S感染U937巨噬细胞,吞噬作用后收集胞内细菌,用FDA荧光染料染色后经流式细胞仪检测,并与平板菌落计数法比较两者检测结果,建立一种检测结核持留菌快速而有效的方法。为下一步胞内重组M.S的生存机制及抗持留菌药物研究奠定基础。方法:1.首先,根据Genbank中eis基因(GeneID: 885903)编码序列设计引物,在设计的引物两端分别加上限制性内切酶识别位点。提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,以之为模板进行PCR扩增,获得eis基因。2.双酶切PCR产物和大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261,电泳回收目的基因片段和载体。用T4 DNA连接试剂盒连接,产物转化感受态大肠杆菌DH5α,在含Kan的LB平板上筛选阳性克隆,重组质粒命名为pMV-eis。酶切和测序鉴定eis克隆的准确性。3.制备M.S感受态细胞,以空白质粒pMV261作为对照。利用电穿孔的方法将质粒导入到感受态M.S中,经Kan抗性筛选,限制性酶切分析等鉴定构建成功的重组M.S菌株。用SDS-PAGE和Western blot分析eis基因在耻垢分枝杆菌中的诱导表达。4.重组M.S胞内活力检测研究:调整U937细胞和重组M..S的浓度,按一定的比例以重组M.S感染U937细胞,以负载pMV261空质粒的M.S为对照,分别于4、12、24、48 h收获细胞。以含0.1% Triton X-100的PBS裂解细胞,收集胞内细菌。获得的胞内细菌用流式细胞仪和FDA染色法检测判断重组M.S在胞内的活力,并与平板菌落计数法进行比较。结果:1.设计了eis引物,采用PCR方法从H37Rv基因组中扩增出相应大小的目的基因片段,将其与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261连接,限制性酶切和测序鉴定穿梭表达载体构建成功。2.将成功构建的重组质粒利用电穿孔的方法转入M.S mc2155中,经Kan抗性筛选、限制性酶切分析鉴定重组M.S构建成功。采用SDS-PAGE和Western blot证实eis能在M.S中成功表达。3.筛选稳定表达的菌株,按MOI=10:1的比例以重组M.S感染U937细胞。用流式细胞仪检测经FDA染色的胞内细菌。结果显示:感染4 h后,胞内重组M.S细菌的死亡率与负载空质粒的M.S对照组无明显差异。但随着时间的延长,感染12、24、48 h后,前者的死亡率明显低于后者对照组。4.按MOI=10:1的比例以重组M.S感染U937细胞,使用公式:死亡率=[1-(未被吞噬细菌量+胞内活菌量)/感染用总菌量]×100%,得出平板菌落计数法获得的重组M.S在胞内的死亡率,与流式细胞仪结果比较。结果显示:流式细胞仪判断结果与平板菌落计数法一致,两者差异无统计学意义。结论:1.成功构建了pMV-eis大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒;2.成功将pMV-eis电转化入M.S中,构建了重组M.S。3. SDS-PAGE成功的检测到M.S能诱导表达eis基因产物Eis蛋白,Western blot证实所表达的蛋白具有一定的免疫原性。4.流式细胞仪证实eis基因能增强重组M.S在胞内持留,与平板菌落计数法判断结果一致。流式细胞术与传统的平板计数法相比具有快速、敏感、方便的特点,可用于胞内分枝杆菌活菌快速检测。