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子宫内膜炎是奶牛产后常见疾病,常导致授精次数增加,屡配不孕等繁殖障碍,使淘汰率升高,造成巨大的经济损失。大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是奶牛子宫内膜炎常见的致病菌。E.coli是一种革兰氏阴性菌,主要通过脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)发挥致病作用,但大肠杆菌诱导奶牛子宫内膜炎的发病机制和LPS在致病中的作用仍有待探究。临床研究表明,围产期孕酮水平的变化对于奶牛子宫内膜炎的发病有一定影响,但影响机制还不清楚。本文选用大肠杆菌和LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎症模型,从分子角度探究孕酮对炎症相关因子和通路的调控,为子宫内膜炎的防控提供理论依据。本研究使用的细胞为体外培养的奶牛子宫内膜原代细胞。通过机械法和酶消化法相结合的方式,培育出稳定传代的奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,BEECs),用CCK8法检测孕酮对细胞活性的影响,用Western Blot检测MAPK和NF-κB信号通路中关键蛋白的表达。结果显示:1、3、5ng/mL孕酮对BEECs活性没有影响;1、3、5 ng/mL孕酮作用于奶牛子宫内膜上皮细胞0.5 h未引起MAPK和NF-κB信号通路的明显变化。为探究孕酮对E.coli诱导的BEECs炎性反应的影响,选用105 CFU/mL的E.coli处理上皮细胞作为炎症模型组,加入不同浓度(1、3、5ng/mL)孕酮和E.coli共处理细胞,分别于处理2、4、6 h后采用qPCR检测细胞炎性因子TNF-α、IL-lβ、IL-6和IL-8的基因表达;共处理0.5 h后采用Western blot检测MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白的表达。结果显示:与空白组相比,炎症模型组的炎性细胞因子在2、4和6h表达增加(p<0.01);MAPK和NF-κB信号通路p38、JNK和Erk以及NF-κB通路IκBα、p65蛋白的磷酸化水平在处理0.5h均升高(p<0.01);在2、4和6h,各试验组(孕酮与E.coli共处理)炎性因子基因表达相对于模型组均明显下降(p<0.01);与E.coli模型组相比,孕酮和E.coli共处理组的细胞在0.5 h时其蛋白磷酸化水平有不同程度的降低(p<0.01)。为了探究孕酮对LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性反应的影响,采用CCK8法筛选出造模所用LPS浓度,以建立LPS炎症模型。加入不同浓度(1、3、5 ng/mL)孕酮和1μg/mL LPS共处理细胞,分别于3、12和18h检测炎性细胞因子TNF-α,IL-1β、IL-6和IL-8的基因表达;共处理0.5 h,检测MAPK和NF-κB信号通路关键蛋白的表达。结果显示:与空白组相比,模型组的细胞炎性因子和信号通路蛋白磷酸化水平均升高,与大肠杆菌试验一致。与炎症模型组相比,孕酮(1、3、5 ng/mL)与LPS共处理组的炎性细胞因子基因表达在12 h和18 h均明显下降(p<0.01);3和5 ng/mL孕酮和LPS共处理组的炎症信号通路蛋白的磷酸化水平与模型组相比显著下降(p<0.01)。综上所述,孕酮可抑制Ecoli和LPS诱导的BEECs的MAPK和NF-κB信号通路的激活,同时降低炎性细胞因子的表达,从而发挥抑炎作用。