论文部分内容阅读
目的通过检测慢加急性肝衰竭患者外周血单个核细胞中肿瘤坏死因子-α的甲基化状态与蛋白表达水平的关系,探讨肿瘤坏死因子-α及表观遗传调控在慢加急性肝衰竭发病机制中的可能作用。方法1、研究对象慢加急性肝衰竭患者组20例,慢性乙型病毒性肝炎患者组12例,为2009年3月-2009年12月山东大学齐鲁医院肝病科住院和门诊患者,均符合2000年(西安)第十次全国传染病寄生虫病学术会议修订的“病毒性肝炎诊断标准”。健康对照组12例。2、研究方法ELISA法检测外周血肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,并与患者的肝功能进行相关性分析,主要检测谷丙转氨酶(ALT)、血清总胆红素(TBIL)水平、凝血酶原活动度(PTA)、血清乙型肝炎病毒定量、终末期肝脏病模型(MELD)评分。观察慢加急性肝衰竭患者不同病情程度血清TNF-α表达的变化,初步探讨TNF-α在慢加急性肝衰竭发病机制中的作用。提取外周血单个核细胞DNA,重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。根据修饰后DNA序列的不同,运用在线MethPrimer软件设计引物,甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)检测标本中TNF-α扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。分析TNF-α启动子甲基化与血清TNF-α表达的相关性,并分析甲基化与病情严重程度的相关性,探讨DNA甲基化在慢加急性肝衰竭发病机制中的作用。3、统计学分析：采用SPSS16.0软件进行统计分析,实验数据用均数±标准差(X±S)表示。用t检验进行两组间比较,方差分析行多组间比较,率差异行卡方检验,Spearman等级相关分析进行两因素相关性检验,均以P<0.05为有显著性差异。结果1.外周血清TNF-α表达：慢加急性肝衰竭患者组外周血TNF-α蛋白水平均高于慢性乙型病毒性肝炎患者组和健康对照组,且各组间比较均具有显著性差异(P<0.05)2.慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF-α水平与血清ALT关系：统计结果显示外周血清TNF-α水平与血清ALT无明显相关性(r=-0.185,P=0.435)。3.慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF-α水平与血清TBIL关系：统计结果显示外周血清TNF-α水平与血清TBIL呈明显的正相关(r=0.891,P<0.01),TBIL较高的患者外周血清TNF-α水平明显高于TBIL较低的患者。4.慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF-α水平与PTA关系：统计结果显示外周血清TNF-α水平与PTA呈明显的负相关(r=-0.511,P=0.021),PTA越低的患者外周血清TNF-α水平明显高于PTA高的患者。5、慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF-α水平与血清HBV-DNA的关系：统计结果显示外周血清TNF-α水平与血清HBV-DNA之间无显著的相关性(r=-0.026,P=0.912)。6、慢加急性肝衰竭患者组外周血清TNF-α水平与终末期肝脏病模型(MELD)评分之间的关系：统计结果显示外周血清TNF-α水平与终末期肝脏病模型(MELD)评分之间呈明显的正相关(r=0.792,P<0.01)。7、慢加急性肝衰竭患者组TNF-α启动子完全甲基化率为15%(3／20),未甲基化率为85%(17／20)。慢性乙型病毒性肝炎患者组完全甲基化率为50%(6／12),未甲基化率为50%(6／12)。健康对照组完全甲基化率为66.7%(8／12),未甲基化率为33.3%(4／12)。慢加急性肝衰竭组、慢性乙型病毒性肝炎患者组、健康对照组TNF-α启动子甲基化状态的差别有统计学意义。(x2=9.343,df=2,P=0.009)。8、慢加急性肝衰竭患者甲基化组与非甲基化组血清TNF-α水平比较,差异有统计学意义,慢加急性肝衰竭患者甲基化组血清TNF-α水平明显低于非甲基化组(P<0.05)。慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化组与非甲基化组血清TNF-α水平比较,差异有统计学意义,慢性乙型病毒性肝炎患者甲基化组血清TNF-α水平明显低于非甲基化组(P<0.05)。健康对照甲基化组与非甲基化组血清TNF-α水平比较,差异有统计学意义,健康对照甲基化组血清TNF-α水平明显低于非甲基化组(P<0.05)。结论1.在慢加急性肝衰竭患者中,血清ALT水平高低已不能反映病情严重程度,而血清TBIL及PTA才是反映肝脏功能的常用指标,前者水平越高,后者水平越低,反映肝脏功能越差。在慢加急性肝衰竭中,通过TNF-α与TBiL和PTA之间关系的比较,发现TBil较高的患者其TNF-α水平也高,提示TNF-α可能与肝炎活动与肝细胞损害有密切关系。血清TNF-α水平与血清HBV-DNA对数值之间无显著相关性,表明HBV本身不能直接影响血清TNF-α水平。MELD评分是反映肝功能损伤程度的良好指标,血清TNF-α水平与MELD评分呈明显的正相关,提示血清TNF-α水平升高能够间接反映肝功能的恶化。TNF-α可以通过多种信号通路导致肝细胞的凋亡和坏死,因而它在慢加急性肝衰竭的发病机理当中具有重要的作用。2.慢加急性肝衰竭患者TNF-α启动子甲基化程度较慢乙肝及健康对照组低,且TNF-α启动子甲基化组血清TNF-α水平较非甲基化组低,DNA甲基化在调控细胞因子表达中起着重要作用。