目的:在西方发达国家,年龄性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）已经成为50岁以上老年人、不可逆的严重眼病之一;随着我国逐渐进入老龄化时代,其发病率亦有上升的趋势。AMD能对老年人造成严重的视力损伤,且治疗费用成本高,给患者、家庭和社会带来长期、多方面的负担;因此,寻找一种能有效治疗AMD的药物并将其制备适宜的剂型,目前成为眼科药的研究热点。本课题根据治疗眼部疾病的中药方剂中常用药物——决明子和黄连,分别选取其主要成分——大黄酚和盐酸小檗碱作为模型药物制成眼部脂质体,并探索同时包封亲水性和亲脂性成分的脂质体制备工艺,提高盐酸小檗碱和大黄酚的载药量;利用可以增加药物细胞膜透过性、组织相容性的第三代聚酰胺-胺型树枝状高聚物（PAMAM G3.0）包覆复合脂质体,并通过稳定性试验、眼部刺激反应、兔在体角膜渗透性试验以及局部药代动力学研究,评价制剂的稳定性、眼部刺激性、药物在体角膜的渗透性以及给药后药物吸收变化,综合评价PAMAM包覆复合脂质体眼部吸收的优越性。方法:1.建立大黄酚、盐酸小檗碱HPLC含量测定方法和包封率方法采用HPLC方法建立可使大黄酚和盐酸小檗碱同时出峰的色谱条件以此建立大黄酚、盐酸小檗碱的含量测定方法。根据两种药物的理化性质,以包封率为指标,考察凝胶色谱柱法、石油醚法、鱼精蛋白法和凝胶柱离心法四种常用的脂质体分离方法,以此筛选出能准确测定、操作方便的药物包封率方法。2.复合脂质体的制作与工艺研究根据大黄酚的理化性质,以包封率为指标,对薄膜分散法和薄膜超声法进行考察;采用薄膜分散-探头超声-p H梯度法制备复方脂质体,以样品状态、包封率为指标,考察处方中磷脂与胆固醇质量比、药酯质量比并且对其工艺中的水化时间、p H、孵育时间进行优化。3.PAMAM包覆复合脂质体的制备与表征利用异硫氰酸荧光素（FITC）标记PAMAM,使PAMAM具有荧光吸收特性,以此建立FITC-PAMAM包覆复方脂质体包覆率的荧光分光光度测定方法,并通过核磁共振验证FITC是否成功连接于PAMAM。以包覆前后的粒径、Zeta电位和荧光强度为评价指标,对0.5%、0.1%、0.2%的PAMAM/磷脂摩尔比进行筛选;通过透射电镜进行形态观察,确定PAMAM是否成功包覆于脂质体表面;按照最佳PAMAM/磷脂投料比制备包覆复合脂质体,并进行相关的质量评价。以粒径、大黄酚和盐酸小檗碱的包封率和包覆脂质体的澄清度为评价指标,在低温（4℃）与室温的条件下,考察PAMAMA包覆复合脂质体的稳定性。同时对复方脂质体进行冻干,并进行冻干复溶后测复溶后脂质体的药物包封率以及脂质体粒径4.眼部刺激性和动物在体渗透性评价以新西兰兔为受试动物,随机分成3组,每组左眼分别给予空白脂质体组、复方脂质体组、PAMAMA包覆复合脂质体组进行试验,右眼作为自身对照,一天给药3次,每次间隔4h,以Draize眼部刺激性评价标准考察单次给药眼部刺激性;同时,在眼部刺激性评价标准的基础上结合组织病理切片,按照单次给药方式连续给药14天,考察PAMAMA包覆复合脂质体组长期眼部刺激性;利用尼罗红染料对制剂进行染色,使制剂具有荧光特性,并对家兔分组给药,于固定时间点处死,取其角膜制作切片,通过倒置荧光显微镜观察切片荧光分布状况,考察0.5%羧甲基纤维素钠复方溶液、复方脂质体、PAMAM包覆复方脂质体的角膜在体渗透性。5.大黄酚、盐酸小檗碱的体外探针回收率方法建立选取30%乙醇生理盐水作为灌流液,通过采用透析法和反向透析法对不同流速的考察流速对探针回收率与探针损失率的影响;利用反向透析法对体内探针回收率进行考察。6.房水中盐酸小檗碱LC-MS-MS方法的建立由于脂质体中盐酸小檗碱的投料量少,故采用LC-MS-MS建立检测方法。建立房水中盐酸小檗碱的分析方法并进行方法学考察。7.新西兰兔眼部给予0.5%羧甲基纤维素钠复方溶液、复方脂质体、PAMAM包覆复方脂质体后的局部药动学比较选取12只新西兰兔随分成三组,每一组分别给予0.5%羧甲基纤维素钠复方溶液、复方脂质体、PAMAM包覆复方脂质体,每组给予50μl样品溶液后采用微透析技术进行收集,每隔20min后收集一管,共收集6h。样品放置于-20℃储存,并使用LC-MS-MS进样分析;数据采用DAS软件处理并拟合药时曲线,算出各组药动学参数。结果:1.确定大黄酚/盐酸小檗碱的色谱条件为甲醇:0.1%磷酸梯度洗脱,并通过方法筛选确定鱼精蛋白法和凝胶柱层析法分别为大黄酚、盐酸小檗碱包封率测定方法。2确定复方脂质体的制作工艺为:磷脂/胆固醇/大黄酚/盐酸小檗碱=100:25:1.25:4时,40℃水化50 min,冰浴超声3.3min（工作时间2.2s,间歇间2.2s,功率200w）,分别过0.45μm、0.225μm微孔滤膜整粒,整理后的大黄酚脂质体混悬液调节其p H为7.0,60℃孵育20 min,制得复方脂质体,其大黄酚包封率为51.59±3.82,盐酸小檗碱包封率为89.6±3.63,平均粒径为104.4±17.21nm,制备工艺稳定,体系均一,为PAMAMA包覆复合脂质体提供了基础。3.通过1H-NMR图谱表明FITC的异硫氰酸根成功连接在PAMAM的氨基上;透射电镜显示PAMAM G3.0能较好包覆于脂质体表面;通过以粒径、zeta电位和包覆率为评价指标,发现包覆后的脂质体粒径略有增大,且包覆后的脂质体zeta电位由正转为负,电位强度随着摩尔投料比逐渐增强,其包覆率也随着该投料比逐渐增大。综合考虑选用磷脂/PAMAM摩尔比为0.2%。测得0.2%的PAMAM G3.0包覆复合脂质体中大黄酚包封率为80.69±0.96,盐酸小檗碱包封率为93.99±0.052,说明PAMAM能进一步提高药物的包封率。以粒径、大黄酚和盐酸小檗碱的包封率以及包覆脂质体的澄清度为指标,在低温（4℃）与室温的条件下检测,结果表明:一个月内PAMAMA包覆复合脂质体在两种不同的储存条件下外观均无明显变化;在室温下,粒径无太大变化;但在低温状态下,粒径略有增大;在两种储存条件下,大黄酚和盐酸小檗碱的包封率均有下降,以大黄酚下降最为严重,且在30天后基本无法检测;盐酸小檗碱包封率在低温条件略有下降;室温下,盐酸小檗碱包封率下降较严重。脂质体进行冻干复溶后与未冻干脂质体进行比较发现,冻干复溶后脂质体粒径略有增大,大黄酚包封率基本无变化而盐酸小檗碱的包封率略有下降。4.空白脂质体组、复方脂质体组、PAMAM包覆复合脂体组进行单次给药后,均未产生明显眼部刺激性;PAMAM包覆复方脂质体组连续给药14天后无眼部刺激性,角膜、虹膜和结膜均无明显损伤。以0.5%羧甲基纤维素钠复方水溶液、复方脂质体和PAMAM复合脂质体尼罗红染料标记后15 min均可扩散至角膜内皮层,但在30 min和1h后,0.2%PAMAMA包覆复合脂质体、复方脂质体组渗透性仍能渗透至角膜内皮层,且PAMAM包覆复方脂质体在角膜上的渗透荧光强度比复方脂质体强、均匀,但0.5%羧甲基纤维素钠复方水溶液无明显扩散现象。5.以30%乙醇生理盐水作为房水灌流液,随着流速增大,探针回收率变低;且通过透析法与反向透析法分别测大黄酚、盐酸小檗碱的探针损失率与探针回收率,由结果可知探针损失率与探针回收率基本相等;通过反向透析法测定体内稳定性可知,在7 h内大黄酚、盐酸小檗碱探针回收率稳定性较好,但在不同的时间点内均出现一定的波动。6.利用LC-MS-MS建立房水中盐酸小檗碱的测定方法,该测定方法专属性好、简便、准确度高,符合样品分析要求。7.复方脂质体和PAMAM包覆复方脂质体曲线下面积分别是0.5%CMC-Na复方水溶液的1.33倍以及1.643倍,复方脂质体和PAMAM包覆复方脂质体的最大药物浓度分别为水溶液的1.719倍和1.23倍,且达峰时间延迟。证明PAMAM包覆复方脂质体具有促进角膜的渗透作用以及延长角膜滞留时间。结论:通过HPLC成功建立大黄酚、盐酸小檗碱的含量测定方法,并以此确定该两种药物的包封率测定方法;通过单因素考察确定复方脂质体的处方与研究工艺,为制作PAMAM包覆复方脂质体提供基础;滴注法能有效制作PAMAM包覆复方脂质体,且PAMAM包覆复方脂质体在低温状态下能增加稳定性,并通过冻干工艺进一步稳定制剂;在一定给药剂量下,PAMAM、处方中的辅料以及药物对眼部均无刺激性,证明PAMAM包覆复方脂质体具有一定安全性;PAMAM脂质体具有良好的角膜渗透性;PAMAM包覆复方脂质体后能提高药物利用度以及药物渗透性,为该剂型能药物递送到达到眼后部提供一定依据。