葡萄糖浓度漂移对血管内皮细胞伤害程度及机制的研究目的糖尿病（diabetes mellitus,DM）是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱。并且往往合并动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）大血管并发症。高血糖是糖尿病的标志,也是导致糖尿病慢性血管并发症的主要因素。高血糖对糖尿病患者的病理作用可能主要有两种形式,慢性波动性高血糖与慢性持续性高血糖。慢性波动性高血糖是指慢性间歇性或阵发性高血糖状态,也称血糖漂移（intermittent glucose）。而最近的研究发现前者更能促进糖尿病患者大血管并发症的发生与发展。相同HbAlc病人由于血糖波动大小不同,其并发症风险存在巨大差异,也就是波动性高血糖加速动脉粥样硬化的进展。因此,引起糖尿病大血管并发症防治领域学者们的关注。目前国外已有这方面的研究结果发表,国内少见到这方面的报告,且多为临床观察研究,而本研究通过观察在不同葡萄糖浓度状态下对培养的人脐静脉内皮细胞株凋亡,生存抑制率及形态学的改变,从基础领域方面探讨血糖漂移对血管内皮细胞的损害及引发动脉粥样硬化机制。2型糖尿病的血糖增高,特别是血糖波动对心血管内皮细胞的损害已被人们证实。而血管内皮细胞并不只是血管内层的屏障,由于它具有分泌功能,所以已被认为是最大的内分泌器官。在血糖波动状态下,血管内皮细胞功能改变,导致一些细胞因子合成及活性的改变造成内皮细胞损伤,诱导内皮细胞发生凋亡是动脉粥样硬化的发病机制之一。目前认为AS是一个以炎症为基础的疾病。国内外已有许多研究发现转化生长因子（transforming growth factor—β1 TGF-β1）在动脉粥样硬化的发病中起着重要作用,但在血糖波动条件下血管内皮细胞TGF-β1的表达和分泌变化未见报道。TGF-β1对血管内皮细胞的作用是抑制内皮细胞增殖。故本研究通过培养血管内皮细胞在波动葡萄糖浓度环境下TGF-β1mRNA表达和蛋白量变化,探讨波动性高血糖对血管内皮细胞伤害程度及机制,以及在动脉粥样硬化发生发展过程中的意义。2型糖尿病大血管病变表现为动脉粥样硬化,也是2型糖尿病最常见的并发症,与非糖尿病病人动脉粥样硬化不同,糖尿病病人的动脉粥样硬化发生早,进展快,预后差,是糖尿病病人致死致残的主要原因。近年来研究发现基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）作为一种降解细胞外基质的蛋白酶,能促进动脉粥样硬化（AS）斑块的形成,发展及破裂,在AS病变时增高。并且已有实验表明高糖可以诱导内皮细胞表达MMP-9,特别在AS时有单核细胞存在条件下这种作用更明显。但在葡萄糖浓度波动状态下MMP-9表达情况目前研究报告很少,故本研究通过培养内皮细胞和人髓系白血病单核细胞株THP-1在葡萄糖浓度波动状态下应用分子生物学技术测定MMP-9 mRNA表达及蛋白水平的变化,以探求葡萄糖浓度漂移对对血管内皮细胞的MMP-9mRNA表达及蛋白量变化及其在2型糖尿病大血管病变中的作用。实验方法1、细胞培养和计数血管内皮细胞株ECV304购自中国培养物典藏中心。将冻存的血管内皮细胞株ECV304投入37℃温水中,摇动使尽快解冻。吸出细胞悬液并加入含10%胎牛血清DMEM培养液10m L,混匀,1000转/min离心5min,弃上清用培养基稀释混匀,接种于培养瓶中,37℃5%CO₂孵箱中孵育,细胞贴壁后每2天换液一次,直至长满并融合成单层。用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液1;1消化,传代比例为1;2,其他条件不变。取对数生长期细胞,计数细胞后调整细胞数分别接种于250ml,50ml培养瓶及6孔,96孔培养板中待细胞均匀铺满容器底面后,分组实验。6孔培养板中每孔中内置高压消毒后的盖玻片一片,以备细胞爬片。检测MMP-9时的细胞培养为ECV304和THP-1。2、实验分组将上述培养细胞更换含1%胎牛血清的培养基中培养24小时,使细胞处于饥饿状态同时细胞同步于G0/G1期,然后分四组（为避免渗透压对实验结果的干扰而设立20mmol/L甘露醇组）;①5mmol/L葡萄糖组;②20mmol/L甘露醇组;③20mmol/L葡萄糖组;④5mmol/L葡萄糖和20mmol/L葡萄糖每24小时交替培养组应用无血清培养基37℃5%CO₂孵箱中培养14天进行实验。3、MTT检测细胞存活率将96孔培养板中培养的细胞每孔加入MTT（四甲基偶氮唑盐）溶液20μ137℃继续孵育4小时,然后吸去孔内上清液,加入150μ1DMSO振荡10分钟。选择490nm波长在酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值。细胞存活率=处理组细胞的OD平均值/对照组细胞的OD平均值×100%。4、细胞凋亡的检测应用异硫氢酸荧光素标记膜联蛋白V（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡。PBS冲洗一次后,用1×结合缓冲液悬浮细胞至1×10⁶/ml,取100μ1细胞（1×10⁵）稀释至5ml加入含5μ1异硫氢酸荧光素标记膜联蛋白V（Annexin V-FITC/PI）,10μ1碘化丙啶（PI）混匀后,避光室温孵育15min,每管加入400μ1,1×结合缓冲液,并上机检测。5、吖啶橙（AO）细胞荧光染色取6孔培养板中盖玻片上的已经分组按上述方法培养的细胞,PBS洗三次,95%乙醇固定20 min,,1%醋酸作用30 sec,加入0.01%AO染色5 min,PBS清洗1min,,0.1mmol/L CaCl₂分色2 min,PBS清洗3次,甘油;PBS1;1封片,荧光显微镜下405nm滤光片立即观察。6、RT-PCR法检测的mRNA表达Trizol提取细胞总RNA,测OD₂₆₀/OD₂₈₀,计算RNA浓度。取2μgRNA逆转录为cDNA,取cDNA2μ1进行PCR扩增。反应体系为12.5μ1,94℃预变性2min,94℃40sec,60℃40 sec,72℃1 min共35个循环,72℃终末延伸5min。取PCR产物5μ1电泳分离后进行扫描分析,以β-actin条带亮度值进行标准校正,计算其相对表达量。7、TGF-β1（ELISA方法）含量检测;从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,除外空白孔,分别将标本（标准品）100μ1/孔加入,封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育90 min。洗板4次,甩净孔内液体,每孔加洗涤液350μ1,静置30 sec甩净,在厚叠吸水纸上拍干。加入生物素化抗体工作液封住反应孔37℃孵育60 min,洗板,空白孔外加入酶结合物工作液（100μ1/孔）封住反应孔,37℃孵育30 min,洗板,加入显色剂37℃孵育20 min,加入终止液。测OD450值。8、TGF-β1免疫组化检测将上述培养于6孔板中盖玻片上14天人脐静脉内皮细胞应用95%乙醇固定过夜,30%过氧化氢水和100%甲醇混合液（1;50）室温浸泡30 min,以灭活内源性过氧化物酶。PBS冲洗2次,滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min,倾余,不洗,每张片滴加兔抗人TGF-β1多克隆抗体（1;50）4℃过夜;PBS冲洗,加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗,20℃孵育20 min,PBS冲洗;滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液SABC 20℃20 min,PBS冲洗。DAB显色15 min,苏木素复染,中性树胶封片。9、Westernblot定量检测内皮细胞接种于250mi培养瓶中,于培养14天后将细胞收集。收集的细胞悬于250μ1冰冷缓冲液中（含有20mmol/LTris-HCL,pH7.5,0.1mmol/LNa₃VO₄,25mmol/L NaF,25mmol/Lβ-glycerophosphate,2mmol/LEDTA,2mmol/LEGTA,1mmol/LDTT,lmmol/LPMSF）冰浴中将细胞超声粉碎,4℃12000g离心60 min,沉淀。吸取上清,考马斯亮蓝法（Bradford法）测定样本中蛋白浓度,然后将每个样品中蛋白浓度调至相同。样品中加入样品缓冲液,沸水煮5 min,每个样品取20μ1上样于10%SDS-PAGE分离,BIO-RAD电泳板,双板条件为150V,30mA。硝酸纤维素膜在转印液中平衡10 min,然后遵循胶在负极,膜在正极的原则,经2小时50 V的转印后TTBS洗膜2次,每次5 min,用含5%BSA的TBS室温封闭60 min,加入人MMP-9多克隆抗体（1;300）4℃过夜。TTBS洗膜2次,与HRP标记羊抗兔IgG（1;5000）室温孵育2小时。TBS洗膜2次,每次5 min,加入显色液30 min,采用Chemin Imager 5500型自动电泳凝胶成像分析仪采集图像并对蛋白显色光密度值IDV进行测定和结果分析。Bax和bcl-2操作方法与其相同。10、统计学处理应用SPSS12.0统计软件分析,数据采用x±s表示。组间差异显著性比较t检验。结果1、各种浓度葡萄糖对细胞存活率影响四组细胞经过14天培养,细胞存活率明显不同,经MTT比色法检测结果显示;20mmol/L葡萄糖组内皮细胞存活率低于5mmol/L葡萄糖组,为对照组5mmol/L葡萄糖组的85%,而波动组5/20mmol/L葡萄糖组低于上述两组为对照组5mmol/L葡萄糖组的43%,存活率显著降低P＜0.05。20mmol/L甘露醇组与对照组5mmol/L葡萄糖组比较差异不显著。2、流式细胞术凋亡检测结果该细胞在培养中有一定的凋亡率,经不同浓度葡萄糖处理后应用异硫氢酸荧光素标记膜联蛋白V（AnnexinV-FITC）/碘化丙啶（PI）双染法检测细胞凋亡可较准确且客观地显示凋亡。可将细胞区分为如下四类;AnnexinV-FITC-/PI-为正常细胞,AnnexinV-FITC+/PI-为早期凋亡细胞,AnnexinV-FITC+/PI+为晚期凋亡细胞;Annexin V-FITC-/PI+为机械损伤细胞。在二维坐标图中,横坐标显示FITC信号强度,纵坐标显示PI信号强度。因此,左上象限为机械损伤细胞,左下象限为正常细胞,右上象限为晚期凋亡细胞,右下象限为早期凋亡细胞。在三组不同葡萄糖浓度条件下培养14天后,用Annexin V-FITC/PI双染法标记凋亡细胞,用流式细胞仪分析结果重复三次后统计结果显示血管内皮细胞凋亡率,以均数±标准差表示。与正常浓度5mmol/L葡萄糖组细胞对照组凋亡率16.62%比较,20mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率19.67%;5/20mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率29.11%,5/20mmol/L葡萄糖组与5mmol/L葡萄糖组比较显著降低,P＜0.05;而甘露醇组16.23%与5mmol/L组无差异P＞0.05。3、吖啶橙（AO）细胞荧光染色吖啶橙（AO）与细胞内DNA和RNA都有亲和力,但结合后发出不同颜色荧光,DNA呈亮绿色RNA呈火红色染色。5mmol/L葡萄糖组细胞数量多,染色呈亮绿色,细胞形态正常。5/20mmo1/L葡萄糖组细胞形态变小,荧光变暗,数量减少。20mmol/L甘露醇组与5mmol/L葡萄糖组结果类似。4、RT-PCR法检测表达5/20mmol/LRT-PCR法检测的TGF-β1,MMP9,BaxmRNA表达结果经积分密度值分析比5mmol/L葡萄糖组明显增加P＜0.05;而Bcl-2mRNA表达结果为比5mmol/L葡萄糖组明显减少P＜0.05;5mmo1/L葡萄糖组和20mmol/L葡萄糖组的TGF-β1,MMP9,Bax,Bcl-2mRNA表达无明显差别P＞0.05。结果表明葡萄糖以浓度依赖及浓度作用形式依赖（持续或波动）方式促进内皮细胞TGF-β1,MMP9,BaxmRNA表达;而抑制Bcl-2mRNA表达。5、人脐静脉内皮细胞株（ECV304）细胞内蛋白水平经积分密度值分析本实验中5/20mmol/L浓度葡萄糖培养组MMP-9蛋白明显升高为5mmol/L组2.4倍,差异显著P＜0.05;而20mmol/L组则为5mmol/L组的1.08倍P＞0.05,无明显差异。Bax蛋白也呈现类似的结果;Bcl-2蛋白水平则显示5/20mmol/L葡萄糖组显著低于对照组5mmol/L葡萄糖组。表明葡萄糖以浓度依赖及浓度作用形式依赖（持续或波动）方式促进内皮细胞上述蛋白表达;而抑制Bcl-2蛋白表达。结论1、持续性高浓度葡萄糖将随着葡萄糖浓度的增高呈正相关诱导血管内皮细胞凋亡,而波动性高葡萄糖将比持续性高葡萄糖诱导血管内皮细胞凋亡率更高,所以,波动性高葡萄糖对血管内皮细胞的损害较持续性高血糖更严重。表示波动性高血糖是诱导血管内皮细胞凋亡的独立危险因子。2、波动性高葡萄糖比持续性高葡萄糖更能促进抑制内皮细胞增殖的TGF-β1蛋白分泌及TGF-β1的mRNA表达。本研究提示波动性高血糖可能通过增加细胞炎症因子导致内皮细胞发生损伤,增加内皮细胞凋亡的。3、通过与THP-1和ECV304细胞同时培养发现;波动性高葡萄糖使血管内皮细胞分泌MMP-9蛋白含量及MMP-9的mRNA表达较正常及稳定高血糖更高。4、如上表示波动性高血糖是促进动脉粥样硬化发生的独立危险因子。