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目的:富血小板血浆(PRP)富含多种生长因子,在间充质干细胞的增殖与分化过程中发挥重要作用。冷冻干燥富血小板血浆(LyPRP)的制备可以长时间保存血小板中生长因子的活性,我们通过研究比较了 PRP和LyPRP中生长因子对间充质干细胞的成骨诱导作用。最后以胶原为载体,进行胶原与PRP,LyPRP复合骨修复支架材料的初步研究。方法:第一部分,富血小板血浆(PRP)的提取与冷冻干燥富血小板血浆(LyPRP)的制备,用动物血液细胞分析仪分析PRP,LyPRP,全血中血小板,白细胞,红细胞的含量。PRP与LyPRP两种材料用激活剂激活为凝胶后,通过扫描电镜观察血小板在PRP凝胶与LyPRP凝胶中的分布,以及凝胶内部构造。用酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测激活后的PRP与LyPRP中生长因子释放,例如:TGF-β,VEGF,PDGF-AB。第二部分,通过PRP与LyPRP刺激兔骨髓间充质干细胞来探究两种材料对兔骨髓间充质干细胞的增殖与成骨诱导分化作用。规范提取新生兔骨髓间充质干细胞体外培养至第三代。设定PRP与LyPRP的浓度分别为5%,10%,20%。实验组:PRP与LyPRP条件培养基培养的骨髓间充质干细胞,对照组:成骨诱导培养基培养BMSCs。用CCK-8来检测不同浓度PRP与LyPRP对骨髓间充质干细胞的增殖。FDA/PI染色来分析在第1天,第3天的细胞活性,判断不同浓度的PRP与LyPRP是否对细胞活性有抑制作用。在不同浓度的PRP与LyPRP条件培养基作用下,刺激细胞1、3、6、9天,茜素红染色来验证细胞中是否有钙结节的生成。茜素红定量用来再次验证茜素红染色实验所分泌钙结节中钙盐含量的准确性。碱性磷酸酶染色作为成骨诱导的另一种重要表征,在第9天观察细胞是否有碱性磷酸酶的分泌,来判断细胞是否成功诱导。碱性磷酸酶活性检测对应碱性磷酸酶染色来进一步对实验结果进行验证。在骨髓间充质干细胞培养至1天,3天,6天,9天对其进行相关成骨基因ALP,BMP-2,OCN的检测来探究基因的表达与材料浓度的关系。第三部分,胶原作为载体与PRP和LyPRP分别复合后进行骨修复支架的初步研究。实验分组为,实验组:PRP(5%、10%、20%)+Ⅰ型胶原;LyPRP(5%、10%、20%)+Ⅰ型胶原。对照组:Ⅰ型胶原。酶联免疫吸附实验(ELISA)用来检测在复合了 PRP与LyPRP的胶原中生长因子TGF-β、VEGF与PDGF的释放。扫描电镜用来观察胶原表面血小板的分布情况。DMA力学测试仪用来验证Ⅰ型胶原在加入不同浓度的PRP与LyPRP后,其力学性能的改变与否。随后又对复合PRP与LyPRP水凝胶进行降解实验,算出降解率,找出降解较慢的最优组。将新生兔的骨髓间充质干细胞包裹进复合水凝胶(分别复合了不同浓度PRP与LyPRP的胶原)中。细胞包裹水凝胶在培养了 1天,3天,7天,14天后来判断出加入PRP与LyPRP后胶原的收缩是否能被有效抑制。FDA/PI染色观察骨髓间充质细胞在水凝胶中的生物活性。CCK-8检测判断在复合水凝胶中骨髓间充质干细胞的增殖情况。结果:成功制备出PRP与LyPRP,PRP与LyPRP中血小板的含量远远超过全血中血小板的含量,通过扫描电镜观察到血小板分布在PRP与LyPRP凝胶纤维的表面,在酶联免疫吸附实验中,VEGF与PDGF的含量高于TGF-β。CCK-8实验中,20%PRP与10%LyPRP能有效促进细胞增殖,在20%PRP与10%LyPRP条件培养基培养的骨髓间充质干细胞中,在第9天有明显的钙结节出现,而茜素红定量实验也验证此时钙盐的含量最高。在第9天时,20%PRP与10%LyPRP组中有碱性磷酸酶的分泌,这两个组别在第9天时碱性磷酸酶活性也最高。在相关成骨基因表达中,ALP、BMP-2、OCN的表达在10%PRP与5%LyPRP组别中明显增高。在20%PRP与10%LyPRP中,细胞由于增殖过快,细胞成膜生长,其中细胞的代谢以及细胞所分泌的基质会在一定程度上影响到相关基因的调控,而10%PRP与5%LyPRP 比之前的浓度均减少一个梯度。细胞的增殖处于一个稳态的环境,所分泌的基质等不足以造成对基因的干扰。在PRP与LyPRP复合Ⅰ型胶原的水凝胶中,通过生长因子含量测定,TGF-β的含量高于VEGF与PDGF的含量。扫描电镜观察到血小板均匀分布在胶原表面,且PRP与LyPRP浓度越高,负载在胶原表面的血小板越多。DMA力学检测中10%PRP复合的胶原凝胶块中,力学强度最大。在降解实验中,10%PRP和10%LyPRP水凝胶在PBS中可以缓慢降解。将骨髓间充质干细胞包裹进富含PRP与LyPRP的Ⅰ型胶原凝胶块中,在细胞凝胶块培养至14天后,我们发现在加入了 PRP与LyPRP后的胶原收缩程度明显稳定。FDA/PI染色也表明在10%PRP和5%LyPRP包裹的细胞凝胶中细胞活性最佳。通过CCK-8检测发现在10%PRP和5%LyPRP的复合胶原中,细胞增殖明显增加。结论:PRP和LyPRP均可有效促进骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化。相比PRP和LyPRP处理的BMSCs成骨诱导效果,PRP优于LyPRP。其原因与LyPRP冻干的环境有关,血小板的性能在冻干过程中受到了影响,生长因子的释放有所减缓,为细胞所提供的营养物质及分化功能有所减少。在胶原中加入PRP与LyPRP后,复合胶原水凝胶中生长因子得以缓释,力学性能加强。复合水凝胶与BMSCs共培养后,胶原的收缩具有稳定性且具有较好的生物相容性。依据以上实验结果性能,我们的研究会为骨修复提供一种较好的生物材料供体。