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链霉菌是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阳性菌,是重要的天然抗生素和几丁质酶产生菌。几丁质酶可通过催化几丁质的水解,破坏植物病原真菌细胞壁的主要组分,从而起到抑制植物病害发展的作用。本研究应用平板稀释法从棉花根围土壤样品中分离到了360株链霉菌,采用双层平板法测定它们对棉花黄萎病菌生长的抑制作用。此外还对本实验室保存的24株生防链霉菌进行了抑菌活性测定,这24株生防链霉菌对棉花黄萎菌都表现出很好的抑菌效果。 对表现抑菌活性的185株拮抗链霉菌菌株使用透明圈法测定,发现其中115株有几丁质酶活性。采用水煮法、STE法、SDS法、微波法等4种方法提取链霉菌的DNA,并以链霉菌16SrDNA引物来扩增提取到的DNA。结果表明除STE法外,其他3种方法所提样品都能扩增出预想的约1.6Kb的片段,且利用水煮法可以更快速、有效的提取出适用于PCR分子探测的链霉菌DNA。 从GenBank中检索到26个链霉菌几丁质酶基因序列,根据保守序列,设计了两对PCR引物(Chi-1/Chi-2和Chi-3/Chi-4)。对115株有几丁质酶活性的菌株进行PCR扩增,有112株可以扩增出预期的特异片段。其中48株菌株对两对引物都有扩增产物,92株对Chi-1/Chi-2引物有产物,68株对Chi-3/Chi-4引物有产物。分别选择两菌株的两对引物组合的扩增产物测序,BLAST比较发现这些产物与其对应的几丁质酶基因类型一致,从而证明了两对引物的可靠性,建立了一套可以快速鉴定几丁质酶产生菌的PCR探测方法。 Men-myco-93-63菌株是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离得到链霉菌菌株,经鉴定为玫瑰黄链霉菌。该菌及其次生代谢产物对不同致病力的棉花黄萎病菌及其它多种植物病原菌均表现较强的抑制作用。在本实验室前期研究的基础上进行了该菌株生防相关基因克隆的研究: 1.克隆了Men-men-93-63几丁质酶基因C的催化域区域;PCR扩增得到包含信号肽区、纤维素结合区、几丁质结合区三个结构功能域的变铅青链霉菌几丁质酶C(S.lividans ChiC)基因片段,此片段与催化域部分、质粒pET23b(+)连接,构建成表达载体pLCH转化大肠杆菌,转化子诱导表达后在几丁质酶培养基上表现几丁质酶蛋白活性。