目的:破骨细胞是机体唯一能够吸收骨质的细胞,其生成过多或者骨吸收能力过度增强,被认为是骨质疏松症发生的重要机制。在破骨细胞分化过程中,细胞的糖酵解活性显著提高,并且NF-κB和MAPK信号通路被激活。PFKFB3是一种能够调节细胞糖酵解活性的关键酶。据报道,抑制PFKFB3的表达可以显著降低细胞的糖酵解活性并阻碍NF-κB和MAPK信号通路的激活,因此我们推测其可能参与了破骨细胞的分化调控。本课题旨在探究PFKFB3在破骨细胞分化过程中的作用及潜在分子机制,为骨质疏松症和其它破骨细胞过度激活导致的疾病提供新的干预靶点和治疗思路。方法:1.使用细胞因子RANKL诱导BMMs细胞向破骨细胞定向分化,通过免疫印迹检测PFKFB3在破骨细胞分化过程中的蛋白表达变化情况,通过葡萄糖测定试剂盒和乳酸测定试剂盒检测破骨细胞分化过程中糖酵解活性的变化情况。2.在破骨细胞分化过程中,使用针对PFKFB3的sh RNA腺病毒或者PFKFB3的抑制剂PFK15降低PFKFB3在BMMs细胞中的表达,TRAP染色检测破骨细胞分化情况,F-Actin染色和骨板吸收实验检测破骨细胞执行骨吸收功能的能力,葡萄糖测定试剂盒和乳酸测定试剂盒检测破骨细胞的糖酵解活性,q PCR及免疫印迹检测破骨细胞标志基因的表达情况和NF-κB、MAPK信号通路的激活状况。3.建立卵巢切除小鼠模型,该模型是目前为止模拟绝经后骨质疏松症最常见、最可靠的动物模型。模型建立后,使用PFK15对小鼠进行为期6周的腹腔注射,然后收集小鼠股骨标本,micro-CT扫描检测小鼠骨量变化,骨组织切片染色检测破骨细胞分化情况。4.使用乳酸对PFK15导致的破骨细胞分化受限进行挽救,TRAP染色检测破骨细胞分化情况,免疫印迹检测破骨细胞分化相关标志基因和NF-κB、MAPK信号通路中重要蛋白的表达水平。结果:1.在破骨细胞分化过程中,PFKFB3的蛋白表达水平升高,糖酵解的活性上调,表明PFKFB3可能参与了破骨细胞的分化调控。2.针对PFKFB3的sh RNA腺病毒或者PFKFB3的抑制剂PFK15都可以明显阻碍破骨细胞的分化,减弱破骨细胞执行骨吸收功能的能力并下调破骨细胞标志基因的表达水平,证明PFKFB3对破骨细胞分化以及执行骨吸收功能至关重要。3.PFKFB3的抑制剂PFK15可以部分缓解卵巢切除小鼠的骨量丢失,并在该模型中减少破骨细胞的生成,表明PFKFB3在小鼠体内依然具有调节破骨细胞分化的潜力。4.抑制PFKFB3的表达可以降低NF-κB和MAPK信号通路中重要蛋白分子的磷酸化水平,说明PFKFB3的抑制对破骨细胞分化的阻碍效应可能是NF-κB和MAPK信号通路激活受限所导致的。5.在破骨细胞分化过程中,抑制PFKFB3的表达可以明显减少破骨细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成,降低其糖酵解活性。补充乳酸则可以部分挽救PFKFB3抑制导致的破骨细胞分化受限以及NF-κB、MAPK信号通路激活障碍,表明糖酵解参与了PFKFB3所介导的破骨细胞分化调控。结论:在细胞水平上,抑制PFKFB3的表达能够阻碍破骨细胞的分化并减弱破骨细胞的骨吸收功能,糖酵解参与了PFKFB3所介导的破骨细胞分化调控。在动物水平上,PFKFB3的抑制剂PFK15可以部分缓解小鼠卵巢切除导致的骨量丢失。本研究明确了PFKFB3在破骨细胞分化和执行骨吸收功能中的重要作用,为骨质疏松症和其它破骨细胞过度激活导致的疾病提供新的干预靶点和治疗思路。