论文部分内容阅读
黄连素在抗炎、降低血糖、调节动物机体免疫机能等方面有显著效果。研究发现,黄连素可以降低机体血浆中的胆固醇含量,表明其在调控脂肪代谢方面也有着重要的作用。然而,关于黄连素在调控鱼类机体免疫、氧化应激及营养物质代谢等相关研究报道很少。我们前期研究结果表明,黄连素可显著缓解高脂饲料造成的团头鲂肝胰腺脂肪过量沉积,改善鱼体的氧化应激水平。但是,将黄连素添加在正常脂肪含量饲料中,促进团头鲂生长的同时鱼体发生氧化应激,造成免疫机能和抗病力降低。基于前期研究结果,本试验结合体内、体外试验方法,根据团头鲂(Megalobrama amblycephala)物种的特点,建立高脂模型,并以黄连素作为中草药添加剂,探讨黄连素适宜的投喂模式对团头鲂生长、免疫机能和脂肪代谢的影响。本试验分为以下四个方面的内容:试验一 黄连素对草鱼肝细胞氧化应激及细胞凋亡的影响本试验运用了细胞生物学研究方法,探讨中草药提取物黄连素对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞(L8824)活力、氧化应激和细胞凋亡的影响。用不同浓度黄连素(0 μmol/L,5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 和 100 μmol/L)分别处理体外培养的草鱼肝细胞0、6、12和24 h,采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示,黄连素浓度和时间对细胞活力有显著(P<0.05)交互作用,且黄连素浓度对其活力影响差异显著(P<0.05),草鱼肝细胞活力随着黄连素的浓度增加先升高后降低(P<0.05)。在此基础上,设置了黄连素梯度浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L和 100 μmol/L)培养草鱼肝细胞12 h后,收集细胞,测定细胞谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)活性,丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量、细胞凋亡水平和相关基因mRNA表达量。结果表明,与不添加黄连素组相比,当黄连素浓度为100 μmol/L时,细胞GOT和GPT活性、ROS和MDA含量显著(P<0.05)增加。当黄连素的浓度为25和50 μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P<0.05)升高;当黄连素的浓度增加到100 μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P<0.05)降低。当黄连素的浓度为50和100μmol/L时,细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA 表达量显著(P<0.05)升高。试验二 团头鲂微管相关蛋白轻链3(LC3B)的克隆和组织分布试验采用RACE技术克隆团头鲂微管相关蛋白轻链3(LC3B)基因cDNA全序列,并且分析其组织表达差异性。克隆得到的LC3B基因cDNA序列全长1871 bp,含有一个378 bp的开放阅读框,编码125个氨基酸。LC3B蛋白的分子量为14.74kDa,等电点为8.76。团头鲂LC3B的蛋白序列与哺乳动物相似,含有一个GABA受体相关蛋白的泛素结构域(GABARAP)、C端氨基酸残基、微管蛋白结合位点、ATG7结合位点和脂化位点。团头鲂LC3B蛋白与鲤科鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲤鱼(Cyprinus carpio)有较高的相似性。经检测发现,团头鲂LC3 B在肝胰腺、脂肪组织和脑中表达量最高,其次是心脏、肌肉,在鳃、肠道、肾脏、脾和皮肤中表达量最低(P<0.05)。试验三 黄连素不同投喂模式对团头鲂生长、氧化应激和免疫机能的影响本试验以高脂饲料诱导的团头鲂脂肪代谢异常模型为试验对象,旨在通过测定团头鲂生长、氧化应激和免疫机能等指标筛选黄连素适宜投喂模式。试验设计了 2个脂肪水平(脂肪水平5%和脂肪水平10%)和黄连素的4种投喂模式(不投喂、间隔两周、间隔四周和连续投喂),配置了 4种等氮饲料,分别为正常饲料(脂肪水平5%)、高脂饲料(脂肪水平10%)、添加50 mg/kg黄连素的正常饲料和高脂饲料。本试验将团头鲂幼鱼(均重4.70±0.02 g)随机分成8组,每组设置4个重复,每个重复放置30尾,饲养8周。养殖8周试验结束之后,进行嗜水气单胞菌攻毒试验,记录攻毒后96 h的累积死亡率。结果显示:黄连素投喂模式对鱼体脂肪水平、免疫机能及氧化应激水平有显著性影响(P<0.05)。随着脂肪水平升高,团头鲂幼鱼增重率和肝体比显著降低,脏体比显著升高(P<0.05)。当饲料脂肪水平由5%上升至10%,团头鲂幼鱼血液中甘油三酯和总胆固醇含量显著上升(P<0.05)。在相同脂肪水平下,黄连素间隔两周、间隔四周和连续投喂组的甘油三酯和胆固醇含量显著降低(P<0.05)。随着饲料脂肪水平升高,团头鲂幼鱼血浆溶菌酶活性(LYZ)、补体C3和C4含量显著升高,酸性磷酸酶活性(ACP)显著降低(P<0.05)。在相同脂肪水平下,黄连素间隔两周组酸性磷酸酶活性、溶菌酶活性、补体C3含量和C4含量显著升高(P<0.05)。随着饲料脂肪水平的升高,团头鲂幼鱼肝胰腺丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05),过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶活性(SOD)呈现上升的趋势,但是差异不显著。在相同脂肪水平下,黄连素间隔两周组,丙二醛和脂质过氧化物(LPO)含量显著降低(P>0.05),超氧化物歧化酶活性显著升高(P<0.05)。随着饲料脂肪水平的升高,团头鲂幼鱼的肝细胞凋亡率和LC3B表达量显著上升(P<0.05)。在相同脂肪水平下,黄连素间隔两周、间隔四周、连续投喂组的肝细胞凋亡率显著降低(P<0.05),黄连素连续投喂组的LC3B表达量显著增加(P<0.05)。试验四 黄连素适宜投喂模式对摄食高能饲料团头鲂生长和肠道免疫机能的影响在试验3的基础上,本试验以高能饲料诱导的团头鲂脂肪代谢异常为模型,进一步验证黄连素适宜投喂模式对团头鲂生长和肠道免疫机能的影响。试验采用2×3因子设计了3种饲料和2个黄连素水平,配置6种饲料,分别为基础饲料、低蛋白高脂饲料(蛋白水平28%,脂肪水平10%)、低蛋白高糖饲料(蛋白水平28%,糖水平43%)以及添加50mg/kg的基础饲料、低蛋白高脂饲料和低蛋白高糖饲料。试验选取初体重为(44.83±0.06 g)的团头鲂360尾,随机分成6组,每组设置4个重复,每个重复放养15尾实验鱼,养殖周期为8周。其中,黄连素采取间隔两周的投喂模式。养殖试验研究结果表明,添加50 mg/kg黄连素组的末均重、增重率和特定生长率显著高于不添加黄连素组,饵料系数显著低于不添加黄连素组(P<0.05)。随着蛋白水平的降低,脂肪水平的升高,各组的蛋白质效率比、氮保留率和能量保留率呈现显著升高的趋势(P<0.05)。饲料对各组的水分、粗脂肪有显著影响,随着饲料脂肪水平的提高,水分显著降低,但是鱼体粗脂肪含量显著升高(P<0.05)。黄连素对血液中的免疫指标有显著影响,添加黄连素组的IgG和IgM含量显著高于不添加黄连素组(P<0.05)。饲料和黄连素对肠道通透性、肠道炎症反应和免疫基因指标有显著交互作用(P<0.05)。随着饲料蛋白水平的降低,脂肪和糖水平的升高,血浆中二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸(D-LA)含量显著升高,肠道肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)表达量显著升高,同时肠道主要相容体复合物(MHC)、黏蛋白-2(Muc-2)、黏蛋白-5b(Muc-5b)表达量显著降低(P<0.05)。然而,在饲料中添加黄连素之后,DAO、D-LA、TNA-α和IL-6含量显著降低,MHC、Muc-2和Muc-5b显著升高(P<0.05)。综上所示,体外细胞试验结果表明,当黄连素浓度超过50 μmol/L会抑制细胞的生长,引发氧化应激,影响细胞功能。因此,黄连素在草鱼肝细胞培养液中添加的适宜浓度为0-50 μmol/L。通过养殖试验结果表明,提高饲料中脂肪和糖水平,在一定程度上可以节约蛋白质,降低饲料成本。但是高能饲料的使用会使肠道通透性增强,产生炎症反应,同时降低机体的免疫力。通过在高能饲料中添加50 mg/kg黄连素采取间隔两周的投喂模式,可以促进生长,改善肠道通透性和免疫屏障,提高机体免疫机能。