目的:人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是属于定向感染人体皮肤和黏膜的一类乳头瘤病毒。根据病毒基因序列不同，HPV明确的亚型有120多种，且表现为明显的组织特异性。皮肤型HPV引起的良性的临床疾病为皮肤疣（瘤），粘膜型HPV则诱导良性乳头状瘤，可引起生殖器黏膜上皮肿瘤，如消化道、呼吸道的肿瘤。按其生物学行为不同可分高危型和低危型。HPV高危型可诱导发病率和死亡率较高的宫颈癌。然而无论何种型别的HPV，均具有高度嗜上皮性并有促进角质形成细胞增殖的能力，引起皮肤和黏膜异常增生。HPV广泛存在于自然界中，HPV感染具有极强的地域性，世界上不同国家地区HPV的感染率和分布不同。美国已注册了3种针对HPV感染预防的疫苗，但对于人乳头瘤病毒治疗性疫苗相对于已上市的预防性疫苗进展缓慢，更具有挑战性。主要原因是对机体如何进行自身控制及清除HPV感染的细胞的机制不清楚。根据HPV感染的亚型、部位不同，治疗的方案也有所区别。因此，寻找有效的更加适合国人的预防和治疗HPV感染的方法尤为重要。　　一定温度、时间的温热对于一些疾病已有明确的疗效。并且具有安全、无痛、可持续等优点。因此更容易被患者接受，并在临床上开展。现已在乳腺癌、肺癌等癌症的治疗过程中取得了确切的疗效。近年来，温热在皮肤科也得到了充分研究与应用。如皮肤肿瘤、皮肤真菌感染、皮肤HPV病毒感染等。本实验基于自主知识产权研发的温热治疗仪（专利号zl200820231952.4.）的前期疗效研究所做的统计分析，尤其在治疗趾疣方面，照比常规疗法的治愈率高达近10个百分点。并利用该技术成功治疗复杂性人乳头瘤病毒感染性皮肤病和多种难治性其他疾病，并成功发表多篇SCI论著。研究证明温热可以使正常皮肤及HPV感染的皮肤发生凋亡，并且在后者发挥更大效果。通过研究，温热后发生凋亡主要原理可能是通过溶解角质形成细胞释放HPV成分来促发特异性免疫系统从而消灭HPV。但对于如何发挥该作用的确切机理尚未明确。　　最新研究证明温热可以诱发肿瘤细胞发生自噬，并呈温度依赖性。细胞自噬是通过清除体内功能紊乱的蛋白或受损的细胞器维持内环境稳态的一种重要降解过程。主要分为以下三种方式:1、大自噬;2、小自噬;3、分子伴侣介导的自噬。多种病理生理状态均可诱导自噬的发生。自噬参与多种生物学功能的调控。自噬发生可通过多条信号调节途径。最新的研究表明，自噬在感染性皮肤病、银屑病、光损伤、自身免疫性疾病、皮肤恶性肿瘤中也起到重要的作用。　　细胞增殖、衰老和死亡是构成体内稳态平衡的重要机制，目前依据形态学的不同，将细胞死亡分为凋亡、自噬和坏死。由于其种类的多样性及机制的复杂性，它们之间不可避免存在交叉形成联系，近年来越来越多证据显示，细胞自噬跟凋亡在某些情况下存在协助或拮抗等关系。　　基于以上理论基础，温热可以诱发肿瘤细胞发生自噬，且可引起HPV感染的细胞发生凋亡，凋亡又与自噬之间存在协同拮抗等复杂关系，那是否可以证明自噬在温热治疗HPV感染皮肤病中起着一定作用，尚需进一步研究，这将为温热治疗HPV感染性疾病提供理论依据。　　研究方法:1、实验对象:细胞系来自表达不同HPV拷贝数的宫颈癌细胞系(CaSki、SiHa、C33A)和永生化的人角质形成细胞系(HaCaT)作为研究对象。体外温热的组织标本来自于中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊临床诊断为尖锐湿疣的患者，收集经二氧化碳点阵激光切除皮损部分的残余。2、温热治疗方案:体外温热:水浴锅加热，将尖锐湿疣组织一式两份，浸润至培养基内，分别给予37℃、44℃温热30分钟处理，培养箱培养12小时。细胞温热:采用水浴锅加热方式，方法同体外温热。3、实时荧光定量PCR检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62 mRNA的表达:采用实时荧光定量PCR方法检测LC3，P62 mRNA的表达。按照Qiagen提取试剂说明书提取总RNA;用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega)试剂盒反转录合成cDNA; GoTaq(@)qPCR Master Mix(Promega)试剂盒行实时荧光定量PCR扩增，并对结果进行分析。4、Western blot检测LC3蛋白的表达:采用Westernblot方法检测温热前后LC3蛋白表达水平的变化（LC3是自噬的标志物，自噬一旦形成，胞浆型LC3，即LC3-Ⅰ会酶解掉一小段肽段，转变膜性，即LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值大小可评估自噬水平高低）。应用BCA试剂盒提取细胞中蛋白并检测蛋白浓度;经制胶、电泳、转膜、封闭、一抗过夜、二抗等过程，最终进行显色观察。5、免疫组化检测相关蛋白:石蜡切片4μm，用免疫组化染色技术(SP法)检测LC3表达。石蜡组织切片经多次脱蜡、抗原修复、一抗、二抗、显色、复染等，在20倍物镜下随机选取5个视野，并用Image-pro Plus软件分析平均光密度值。6、MTS检测温热对细胞增殖的影响:利用MTS方法检测温热对细胞增殖的影响。将四种细胞分别接种在96孔板中，分别进行37℃和44℃温热处理，分别于第0、1、2、和第3天进行吸光度值检测。7、流式细胞术检测温热对细胞周期的影响:利用流式细胞术检测温热对细胞周期影响。将细胞接种于六孔板中，分别进行37℃、44℃处理。之后应用PI试剂检测细胞的周期的分布。8、统计学分析:采用GraphPad Prim软件对所得数据进行分析处理，统计学方法采用方差分析或unpaired t test。比较实验组和对照组的差异，P值＜0.05认为有统计学差异。　　结果:1、温热对细胞中自噬表达的影响:利用RT-PCR、Western-Blot方法观察到三种不同拷贝数的宫颈癌细胞系及角质形成细胞在温热处理后自噬相关基因、蛋白表达水平均有不同程度的增高。免疫组织化学方法观察LC3在各组织中的表达情况。结果显示，LC3在HPV感染皮肤组织中呈阳性表达，温热处理后表达水平增高。差异具有统计学意义（P＜0.01)。2、温热对细胞增殖及周期的影响:44℃处理后，四种细胞的增殖水平对比37℃时有所下降，同时流式细胞术结果发现四种细胞在温热处理后，G2M期发生阻滞。　　结论:1、温热可提高HPV感染细胞中自噬水平的表达。2、温热处理后抑制HPV感染细胞的增殖并影响周期分布。3、温热可能通过自噬来影响细胞的增值及周期分布，为温热应用临床治疗提供又一理论基础。