论文部分内容阅读
腺苷在人体生理生化过程中起着重要的调控作用,在医药和食品领域有广泛的应用。发达国家早就开始了发酵法生产腺苷的研究,现今已进入大规模的生产阶段。然而国内发酵法生产腺苷的报道多集中在摇瓶研究,缺乏在发酵罐中的数据。本文以腺苷作为研究对象,以代谢工程理论为指导,对腺苷发酵过程中的两个重要过程参数溶氧和pH进行研究。本论文还以Bacillus subtilis XGL为出发菌株,构建了一系列腺苷基因工程菌,为腺苷工程菌的进一步改造提供了理论依据和研究思路。本文研究了溶氧对Bacillus subtilis XGL分批补料发酵生产腺苷的影响,提出了前20 h控制溶氧在30%-40%,20 h后维持溶氧在10%-20%的两阶段供氧控制模式。在较短时间内(52 h)获得较高的腺苷产量(19.2g/L),与溶氧不控制策略和恒溶氧控制策略(溶氧水平为0%-10%,10%-20%,20-30%,30%-40%)相比,腺苷的产量分别提高了78.6%,66.7%,9.5%,18.6%和32.2%。在两阶段控制溶氧的基础上,研究了腺苷发酵过程中控制不同pH对菌体生长、耗糖、腺苷产量等参数的影响。结果表明,分阶段溶氧与分阶段pH相结合的控制策略最适合腺苷的发酵生产,发酵56 h,腺苷产量达到23.3g/L,提高了21.4%。利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数并在purF基因前插入强启动子P43,得到了一株腺苷工程菌B. subtilis XGLF,不仅过表达嘌呤合成途径中关键酶磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶编码基因purF,而且其下游purM、 purN、 purH、purD基因的表达水平皆有不同程度的提高,这些基因的编码产物可催化更多的嘌呤前体物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氢叶酸进入嘌呤合成途径。腺苷产量和糖苷转化率在B. subtilis XGL的基础上分别提高了17.5%和26.1%。最后,以工程菌B. subtilis XGLF为研究对象,利用穿梭质粒pBE43,将腺苷生物合成途径中的关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(ADSS)基因purA在腺苷工程菌枯草芽孢杆菌B. subtilis XGLF中过表达,得到一株基因工程菌B. subtilis XGLFA。但是游离质粒的形式有诸多弊端,比如容易丢失,给菌体带来代谢负担等,最终未能使腺苷产量提高,并出现了明显下降。