论文部分内容阅读
由支持细胞(Sertoli cell,SC)分泌的乳酸(lactate)除了能作为生精细胞在生精小管的首选能量底物外,还具有抗凋亡作用,其合成过程需要GLUTs(glucose transporters,葡萄糖转运载体)、LDHs(lactate dehydrogenases,乳酸脱氢酶)和MCTs(monocarboxylate transporters,单羧酸转运蛋白)的共同参与。然而各个阶段的生精细胞对高温都十分敏感,在高温环境中,热应激(Heat Stress)就可导致生精细胞凋亡和支持细胞功能的损伤,但细胞内同时存在另外一个机制——自噬(Autophagy),对细胞稳态和功能恢复具有重要作用。自噬可以可在热应激条件下激活,同时还具有清除细胞内受损的蛋白,产生小分子物质的作用,因此,研究热应激诱导的自噬,对研究支持细胞的乳酸分泌及其相关蛋白表达具有重要意义。然而热应激不仅可以导致自噬,还可以诱导细胞发生凋亡(Apoptosis),因此,本实验还需通过对自噬对凋亡的影响,研究热应激状态下支持细胞的存活状态及趋势,然而两者间的相互关系还不完善。本实验的研究目的是探索热应激对支持细胞自噬的影响,及其调节乳酸合成和凋亡的分子机制。本研究的实验材料为体外培养的仔猪睾丸支持细胞,通过培养箱43°C内处理30 min,再在32°C条件以0 h、12 h、24 h、36 h和48 h对细胞进行恢复,来构建热应激模型。利用免疫荧光检测自溶酶体的表达,流式细胞术检测凋亡率,乳酸检测试剂盒检测乳酸浓度,western blot和qRT-PCR检测LC3B-II/LC3B-I(对应基因LC3B)、Cleaved-Caspase-3(对应基因CASP3)、GLUT3(对应基因SLC2A3)、LDHA(对应基因LDHA)和MCT1(对应基因SLC16A1)的蛋白水平和基因的变化趋势。实验结果:(1)热应激后,支持细胞的LC3B-II/LC3B-I和LC3B的水平,在0-48 h呈现出时间依赖性,在24 h两者相对于对照组分别显著上升30.25%和257%。同时24 h的自溶酶体的红色荧光比其他组的亮度都强(P<0.01)。(2)乳酸分泌量、GLUT3(SLC2A3)、LDHA(LDHA)和MCT1(SLC16A1)在热应激后,也呈现出时间依赖性,且24 h具有最大值(P<0.01)。(3)热应激后,支持细胞的凋亡率、Cleaved-Caspase-3和CASP3,在0-48 h同样呈现出时间依赖性,然而其峰值出现在12 h,相对于对照组分别显著增长49%、65.63%和43.27%(P<0.01)。(4)LY294002(20μM)对自溶酶体的形成和LC3B-II/LC3B-I(LC3B)的表达具有显著抑制作用(P<0.01)。(5)LY294002(20μM)显著导致凋亡率上升,并促进Cleaved-Caspase-3和CASP3的表达(P<0.01)。(6)LY294002(20μM)显著促进了支持细胞乳酸的分泌量,以及GLUT3(SLC2A3)、LDHA(LDHA)和MCT1(SLC16A1)的表达(P<0.01-0.05)。综上,热应激通过诱导支持细胞自溶酶体的形成和LC3B-II/LC3B-I(LC3B)的表达,抑制了细胞的凋亡率和Cleaved-Caspase-3(CASP3)的启动,并通过促进GLUT3(SLC2A3)、LDHA(LDHA)和MCT1(SLC16A1)的表达,促进支持细胞的乳酸分泌。这一结论可将自噬作为靶点,为精子质量和精子数量的提高作为研究依据。