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目的:目前恶性肿瘤仍是一种威胁着人类健康的重大疾病。化疗是临床治疗肿瘤的重要方法,而大剂量的化疗药物及其组合往往引起血小板减少症。临床上针对血小板减少症主要治疗方法是输注血小板和应用一些具有促血小板生成活性的药物制剂如 TPO、IL-3、IL-6。最近的治疗研究集中在体外诱导生成造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)来源的巨核细胞(megakaryocytes,MKs)移植。这些研究表明,输注大量的MKs可能会加速血小板减少症患者的血小板恢复。然而,在输注血小板和促进血小板生成时经常被忽视的一个重要问题是肿瘤患者的血小板对肿瘤生长和转移尤其是对肿瘤新生血管的生成具有重要的促进作用,这可能是肿瘤患者预后不良的重要原因之一。因此,为了减少输注的血小板对肿瘤的促进作用,本文主要研究肿瘤抑素基因(tumstatin)修饰后的CD34+HSCs诱导生成的MKs能够产生具有抗血管活性的血小板。 方法:(1)构建pLVX-tumstatin-mCMV-ZsGreen重组载体,并与包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装和滴度的测定。(2)用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集脐血中CD34+造血干细胞于含细胞因子干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)、白介素-3(IL-3)的干细胞培养基中进行预培养两天,待细胞恢复进入分裂期。(3)用构建好的含目的基因的慢病毒以不同的感染复数(MOI)来感染CD34+造血干细胞,以确定最佳MOI值。(4)选择最佳MOI值感染CD34+造血干细胞,并在细胞因子组合培养液中诱导巨核细胞生成,流式细胞仪和形态学检测巨核细胞的生成及产板情况,并通过血小板聚集实验检测生成的血小板的聚集功能。(5)应用RT-PCR法、Western blot法及细胞免疫荧光法检测tumstatin基因的表达,通过人脐静脉内皮细胞管型形成抑制试验研究血小板内容物生物学活性。 结果:(1)成功构建了含目的基因的慢病毒载体,并测得病毒滴度为1×108;(2)100ml左右的脐血经用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集得到CD34+造血干细胞约为1×106,流式测得纯度达98％以上;(3)选择最佳感染复数(MOI)30:1感染干细胞时绿色荧光阳性率最高;(4)细胞在诱导过程中流式观察发现,转染与未转染组细胞都有巨核细胞与血小板的生成,且生长速度和分化趋势基本相同。通过观察血小板聚集实验发现培养的血小板与正常血小板颗粒大小相同均能对凝血酶产生聚集反应。(5)在转染的MKs基因组里,RT-PCR法检测到738 bp tumstatin基因片段。Western blot法检测到tumstatin在转基因细胞来源的血小板中稳定表达以及免疫荧光法在荧光共聚焦显微镜下观察到tumstatin蛋白在巨核细胞胞质内。含tumstatin基因的巨核细胞产生血小板可明显抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成。 结论:实验结果显示构建的含目的基因的慢病毒载体将 tumstatin基因成功导入CD34+造血干细胞,这种基因修饰的CD34+造血干细胞在体外成功诱导分化为巨核细胞,产生了大量的具有聚集功能的血小板,并检测到有tumstatin蛋白的表达,且这种含tumstatin蛋白血小板在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成。