目的和方法：钙内流是肥大细胞活化的充分必要条件。肥大细胞钙内流由钙释放激活钙离子(calcium release activation calcium，CRAC)通道介导。构成CRAC功能的两个蛋白为Orai1和STIM1(stromal interaction molecule1)。阻止肥大细胞钙内流有可能抑制肥大细胞活化从而有可能用于过敏治疗。指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligandby exponential enrichment，SELEX)技术筛选的适配体以其高亲和力高特异性，在临床上显示了广泛和潜在的应用价值。本研究利用SELEX技术筛选针对Orai1蛋白第1膜外区的核酸适配体，利用IgE介导的肥大细胞系LAD2脱颗粒模型，研究核酸适配体对肥大细胞钙通道的抑制效应，探讨核酸适配体通过抑制钙内流进而阻止肥大细胞活化的可能性。本研究分为三部分：(1)培养人肥大细胞系LAD2细胞，生物素标记的IgE致敏，1分子链霉亲和素能结合4分子生物素，从而发挥多价抗原的作用，用链霉亲和素攻击建立LAD2细胞脱颗粒模型，优化IgE最佳致敏浓度，并以组胺和β-氨基己糖苷酶释放为指标检测肥大细胞活化效果；(2)通过序列比对确认Orai1蛋白第1膜外区的11个氨基酸具有Orai1蛋白特异性。针对该Orai1蛋白第1膜外区，采用酶联板为筛选介质的SELEX技术，从人工合成随机单链DNA文库中筛选并制备核酸适配体。酶联免疫吸附试验检测适配体与靶蛋白的特异性结合及亲和力常数(Kd值)；(3)用激光共聚焦显微镜观察核酸适配体对细胞内钙浓度变化的影响，以LAD2细胞脱颗粒模型检测核酸适配体对肥大细胞过敏介质释放的抑制效果，从而观察核酸适配体对肥大细胞活化的抑制效应，探讨针对CRAC新靶点抑制过敏反应的新机制。结果：1.建立了人肥大细胞系LAD2细胞的培养体系及其脱颗粒模型：LAD2细胞倍增时间为10天，LAD2细胞染色和电镜观察细胞核周围含有大量大小不等颗粒。在密度为1×106细胞/mL的培养体系中，优化了生物素标记的IgE的致敏浓度为500ng/mL，链霉亲和素攻击浓度为1000ng/mL。在优化浓度作用下，培养体系中的肥大细胞活化效果最佳。2. SELEX筛选共进行了12轮，各轮产物与Orai1蛋白亲和力呈逐渐升高趋势，于第11轮序列达到最高值。以第11轮富集库序列为基础获得了7条核酸适配体，其中AptamerY1亲和力最高。酶联免疫吸附试验证实了AptmerY1可与Oari1特异性结合。AptamerY1亲和力常数(Kd值)为1.72×10-8mol/L。3.上述步骤制备的AptamerY1可抑制IgE介导的人肥大细胞系LAD2脱颗粒模型，激光共聚焦显微镜观察AptamerY1明显抑制了LAD2钙离子内流。AptamerY1对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95%。说明AptamerY1抑制肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放是通过抑制CRAC介导的肥大细胞钙内流所致。主要结论：建立了人肥大细胞系LAD2细胞脱颗粒模型。通过SELEX筛选，获得了针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体。所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制，进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放。该核酸适配体通过抑制CRAC介导的钙内流进而阻止了肥大细胞活化。本研究为过敏反应治疗提供了新的可能的药物干预靶点。