目的:随着经济发展和人们生活水平的提高,我国糖尿病发病率迅速增加。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见并发症,正在逐渐成为终末肾病的主要原因,其主要病理变化为肾小球、肾小管肥大,肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)堆积以致肾小球硬化、肾间质纤维化。有关高糖对肾小球系膜细胞不良作用的研究很多,对肾间质小管研究较少,近年来研究发现,小管间质病变与肾功能不全的发生和进展密切相关,某些情况下比肾小球病变还重要。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)和内皮素1(endothelin1,ET-1)是两个重要的血管活性激素,除了血流动力学作用外,还有非血流动力学作用,如促进细胞增生、肥大,刺激细胞外基质的合成并抑制其降解,介导炎症反应。糖尿病肾病时两系统处于激活状态,二者的关系也日益受到重视。血管紧张素II受体阻断剂(angiotensin recepter blockade, ARB)能与AT1R特异结合,阻断AngⅡ的作用。本研究应用高糖培养的人肾小管上皮细胞株(HKCs),大鼠糖尿病肾病模型和早期糖尿病肾病患者,从整体、细胞和分子等不同水平观察AngⅡ和ET-1之间的关系。方法1.体外培养的HKCsET-1及其受体表达的检测HKCs分成6组:低糖组(5.5mmol/L葡萄糖,LG);低糖+甘露醇组(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇,LG+M)(排除渗透压的影响);高糖组(30mmol/L葡萄糖,HG);AngⅡ组(5.5mmol/L葡萄糖+10-7mol/L AngⅡ, AngⅡ),高糖+氯沙坦组(30mmol/L葡萄糖,+ 10μmol/L Los, HG+ Los,先加入氯沙坦,1小时后加入高糖培养液);AngⅡ+氯沙坦组(5.5mmol/L葡萄糖+10-7mol/L AngⅡ+10μmol/L Los, AngⅡ+Los,先加入氯沙坦,1小时后加入含AngⅡ的培养液)。分别在24孔板和25 cm2塑料培养瓶内培养。培养6、12、24、48、72h后收集细胞,提取细胞总蛋白、RNA;采集细胞培养上清液用于测定ET-1含量。采用Western blot检测ET-1和ETA受体表达;免疫荧光细胞化学法检测ET-1的表达;半定量RT-PCR检测细胞ET-1、ETARmRNA的表达;酶联免疫法检测细胞上清液中ET-1的含量。2.糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞ET-1及其受体表达的检测54只SD雄性大鼠经水合氯醛腹腔麻醉后行右肾切除术,2周后切口完全愈合。将大鼠随机分为右肾切除对照组和糖尿病(Diabetic mellitus,DM)组,DM组大鼠腹腔单次注射STZ 50mg.kg-1 (STZ用pH 4.5,0.1mol.L-1枸橼酸钠缓冲液配制),对照组只注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液;24小时后,血糖≥16.7mmol /L,尿糖+++～++++确认为糖尿病模型成功。糖尿病大鼠的模型随机分组:糖尿病组和氯沙坦治疗组,治疗组在造模成功后第二天每日给予氯沙坦20 mg/kg灌胃。对照组和糖尿病组给予等量蒸馏水,分别于注射STZ后和治疗后第4周、8周、12周三组各取6只大鼠,称重后收集24h尿,测定尿蛋白(Upro);取血测定尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)及血清ET-1、AngⅡ水平;取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组化检测,部分肾皮质组织用于分离肾小管细胞,提取细胞总RNA和总蛋白。应用Western blot以及RT-PCR、免疫组化染色法检测肾小管上皮细胞ET-1、ETA受体及ET-1、ETA受体mRNA表达情况。放射免疫法检测血AngⅡ,ELISA法检测血ET-1。3.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂联合内皮素受体拮抗剂治疗后早期糖尿病肾病患者血、尿AngⅡ、ET-1水平的检测病例分组:从糖尿病患者中,选择尿白蛋白(malb)含量<300mg/24h的早期糖尿病肾病患者59例,其中男30例,女29例,年龄56～68岁,平均(65±3)岁,随机分为两组:其中氯沙坦治疗组(A组,groupA)29例,男15例,女14例,平均年龄(66±2)岁;氯沙坦+阿魏酸钠治疗组(B组,groupB)30例,男14例,女15例,平均年龄(65±2)岁。取在本院体检的相似年龄的正常人10例作为正常对照组(control group,CG)。两治疗组受试者年龄、性别、体质量指数、糖尿病病程等方面差异均无统计学意义,具有可比性。氯沙坦治疗组(A组)给予50mg/d口服,氯沙坦+阿魏酸钠治疗组(B组)给予氯沙坦50mg/d口服,同时生理盐水250ml加阿魏酸钠300mg静脉点滴,一日一次,疗程4周,所有患者均给予包括饮食控制及根据病情选用口服降糖药或皮下注射胰岛素等常规治疗。用放射免疫法和酶联吸附免疫法检测治疗前后血内皮素、AngⅡ水平,尿内皮素水平及24hmalb。结果1.高糖和血管紧张素Ⅱ对体外培养的HKC细胞ET-1及其受体表达的影响①免疫荧光细胞化学显示,ET-1蛋白在LG组和LG+M组肾小管上皮细胞有少量表达,与LG组相比,高糖组和AngⅡ组细胞自6h起,ET-1蛋白水平开始增加,并且随时间延长表达增强;在24h时表达水平最高,72h时有所下降,但仍明显高于低糖组(P﹤0.01),高糖组和AngⅡ组两组蛋白表达荧光亮度在各时间点无明显差别;高糖+氯沙坦组在各刺激时间点细胞ET-1蛋白表达水平与高糖组相比明显减少(P﹤0.01),AngⅡ+氯沙坦组在各刺激时间点细胞ET-1蛋白表达水平与AngⅡ组相比亦明显减少(P﹤0.01), ET-1在高糖+氯沙坦组和AngⅡ+氯沙坦两组间表达无显著性差异(P>0.05)。②Western blot显示,高糖组细胞自6h起, ET-1蛋白水平开始增高,并且随时间延长增高更加明显;而ETA受体则从12小时开始增高,二者相比ETA受体改变较ET-1慢。AngⅡ组ET-1蛋白水平也是在AngⅡ刺激6小时开始增高,但ETA受体从6小时开始有所增高,随时间延长表达增强,与低糖对照组相比,高糖组和AngⅡ组两组ET-1、ETA受体上调(P﹤0.05)。高糖+ Los组和AngⅡ+Los组随着时间延长ET-1和ETA受体表达逐渐减少。高糖+ Los组ET-1和ETA受体减少从12小时开始变得明显;AngⅡ+Los组减少更明显,且从6小时即有明显变化。③半定量RT-PCR结果显示,ET-1mRNA在低糖组细胞有微量基础表达,不同时间表达无明显差异。低糖+甘露醇组细胞中ET-1 mRNA的表达与低糖组表达无明显差异。高糖组和AngⅡ组自6h起ET-1mRNA表达就开始增加,随着时间延长,其表达也逐渐增加,于第24h表达最高,72小时略有减少,而ETA受体则在48小时表达最高,与低糖组相比均有显著差异(P <0.01)。高糖+Los组和AngⅡ+Los组随时间延长ET-1mRNA和ETA受体mRNA表达减少,低于高糖组和AngⅡ组,但仍高于低糖对照组(P <0.05)。④细胞上清液中ET-1的含量,高糖组和AngⅡ组不同时间点的ET-1含量与免疫荧光表现基本一致,随时间延长而增加,24小时达最高,以后略有减低,但水平仍较低糖对照组为高(P<0.01);高糖+Los组和AngⅡ+Los组细胞上清液中ET-1的含量与高糖组和AngⅡ组细胞上清液中ET-1的含量相比均明显下降,高糖+Los组和AngⅡ+Los组相比AngⅡ+Los组下降更明显,但差异无显著意义(P> 0.05)。2.糖尿病大鼠肾脏的形态学改变及肾小管ET-1、ETA受体的表达光镜下观察,糖尿病大鼠4周时肾小球体积明显增大,近曲小管细胞水肿,部分细胞空泡变性。8周时部分肾小球代偿性肥大,肾小球内细胞数目增加,部分肾小球毛细血管囊萎陷、系膜基质增多;出现较明显的小管间质性损害,表现为小管扩张、小管细胞萎缩和空泡变性、小管基底膜增厚、间质细胞增多,出现炎症细胞浸润。12周时肾小球的萎缩程度进一步加重;与之相比,肾间质的损伤更为明显,大量的近曲小管细胞萎缩,脱落。小管基底膜明显增厚,间质有炎细胞浸润。免疫组化、Western blot和半定量RT-PCR显示,与同期对照组相比,糖尿病模型组大鼠肾小管细胞ET-1及受体的蛋白表达明显升高,preproET-1及受体mRNA表达相应增加(P <0.01)。血清ET-1和AngⅡ水平改变均随时间逐渐增加,与对照组相比改变显著(P <0.01)。氯沙坦治疗组大鼠与同期DM组相比可见如下变化:①肾小管细胞损伤、炎细胞浸润及间质纤维化程度减轻;②免疫组化、Western blot和半定量RT-PCR显示,肾小管细胞ET-1及受体的蛋白表达减少,preproET-1及受体mRNA表达相应减少(p<0.05);③血清ET-1和AngⅡ水平较DM组水平有所降低(p<0.05)。3.氯沙坦及氯沙坦+阿魏酸钠治疗前后早期DN患者血、尿ET-1水平及血AngⅡ水平、24小时malb的改变两组早期DN患者治疗前血AngⅡ、ET-1及尿ET-1、24尿malb水平与正常对照组相比明显高于正常人(p<0.01)。氯沙坦治疗组(A组)血、尿ET-1水平治疗后比治疗前降低,差异有显著性(P<0.01),血AngⅡ水平未见明显改变,差异无显著性(P>0.05);氯沙坦+阿魏酸钠治疗组(B组)血ET-1、AngⅡ,尿ET-1水平治疗后比治疗前亦降低,差异有显著性(P<0.01);两组24hmALB治疗后比治疗前降低,差异有显著性(P<0.01)。结论:①体外培养的肾小管上皮细胞在高糖环境下可表达内皮素及受体的上调,并有时间依赖关系。高于生理浓度的血管紧张素Ⅱ可刺激肾小管上皮细胞内ET-1及其受体的表达上调,并呈时间依赖关系;血管紧张素受体拮抗剂可以抑制高浓度葡萄糖和血管紧张素Ⅱ引起的肾小管上皮内皮素及受体表达上调,血管紧张素Ⅱ和ET-1在人肾小管上皮细胞有相互作用。这种作用可能部分通过两者的共用受体来完成。②大鼠糖尿病肾病时,随着病变时间的进展,肾小管上皮细胞内皮素及受体表达上调,血液中内皮素和AngⅡ水平增高。小管上皮内皮素表达增多会加重肾脏间质的纤维化。Ang II受体阻断剂氯沙坦能够减少大鼠糖尿病肾病模型肾小管上皮细胞的ET-1及其受体表达,有延缓间质纤维化的作用。③早期糖尿病肾病患者体内肾素血管紧张素系统和内皮素系统处于激活状态,血清中血管紧张素Ⅱ和ET-1水平增高。应用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和内皮素受体拮抗剂能够降低早期糖尿病肾病患者血清中二者的水平,两者联合应用比单独应用效果更好。