TPN729是一种新型的用于治疗勃起功能障碍的磷酸二酯酶-5(PDE5)抑制剂,目前在中国已进入临床开发阶段。与已上市的PDE5抑制剂(西地那非、伐地那非、他达拉非和阿伐那非)相比,TPN729表现出了更好的PDE5选择性,对PDE6及PDE11的抑制活性分别低于西地那非和他达拉非,因此不良反应少,而且半衰期相比西地那非得到有效延长。本课题系统研究了TPN729在人体内的代谢与药动学,评价了其在代谢酶和转运体方面引发药物-药物相互作用的可能性,为TPN729进一步的药物开发提供依据,同时还考察了其作为多药耐药逆转剂的开发潜力。1.人体内的代谢与药动学研究三名健康受试者口服25 mg TPN729后,收集不同时间点的血浆和0-24 h尿样和粪样,采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC/Q-TOF MS)检测并鉴定体内的代谢产物。结果表明,口服TPN729后在人体内共检测到22种代谢产物,通过合成对照品的方式确认了其中7种代谢产物的结构,包括:M3(N-去四氢吡咯乙基)、M8(四氢吡咯氧化脱胺)、M11-1(丙氧基羰基化)、M11-2(四氢吡咯羰基化)、M12-2(丙氧基单氧化)、M12-3(丙氧基单氧化)和M13(四氢吡咯氧化开环)。TPN729在人体内经历广泛代谢,代谢途径包括氧化脱胺、N-去烷基、氧化开环、羟基化、羰基化、N-氧化、脱氢及葡萄糖醛酸结合,代谢反应多发生于四氢吡咯侧链。通过代谢物对照品的人肝细胞孵化实验,确认M3可进一步代谢生成M1、M2-1、M2-2、M4-1和M4-2;M11-2可代谢生成M3与M10;M12-3可生成M4-2和M11-1。醛基捕获实验证明M13不是由内酰胺代谢产物M11-2水解开环生成,而是由原形药物四氢吡咯氧化开环生成氨基醛并进一步氧化所生成的羧基代谢产物。人血浆中,达峰时刻与消除相的血浆样品中均主要检测到N-去四氢吡咯乙基代谢产物M3,其他检测到的主要药物相关物质为原形药物M0、磺酰胺N-双去烷基代谢产物M2-2和内酰胺代谢产物M11-2。在尿中检测到的主要相关物质是原形药物M0,其他检测到的少量代谢物主要包括羟基化代谢物M12-1和氧化脱胺代谢物M8。在粪中几乎检测不到原形药物,检测到的主要代谢物M7,M8和M13分别为四氢吡咯发生氧化脱胺或氧化开环生成的代谢产物。结合TPN729在血浆、尿样和粪样中的代谢物谱表明,口服TPN729后吸收完全,TPN729在人体内主要发生磺酰胺N-去烷基、四氢吡咯氧化开环和氧化脱胺代谢,体循环中主要为N-去烷基代谢产物,而未被代谢的原形药物主要通过肾脏排泄。为测定TPN729及其主要代谢产物在人体内的药动学,建立液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人血浆中的TPN729、M3、M8、M11-2和M13,并将其应用于人体药动学研究。结果表明,三名健康受试者口服25 mg TPN729后,TPN729和4个代谢产物在给药后0.83–3.83 h达峰,其中M3达峰时间较原形M0滞后。TPN729、M3、M8、M11-2和M13的Cmax分别为35.8、125、8.26、22.0和18.6 ng/m L,AUC(0-∞)分别为289、2187、51.5、74.8和37.0 ng·h/m L。血浆中最主要的药物相关物质是N-去四氢吡咯乙基代谢产物M3,其Cmax和AUC(0-∞)分别达到原形的3.5倍和7.6倍,而其他三个代谢产物M8、M11-2和M13的血浆暴露量分别为原形的18%、25%和13%。TPN729和4个代谢产物的消除半衰期较为接近(7.75–11.6 h),其中M3的消除略慢于M0。2.基于代谢酶和转运体的药物相互作用研究基于代谢酶的药物相互作用研究中,采用体外代谢模型和体内动物模型考察了TPN729引起药物相互作用的可能性。体外酶表型实验采用重组酶和选择性抑制剂孵化实验,结果表明TPN729是CYP3A4的敏感底物,CYP3A4对TPN729体外代谢的贡献达到70%,酮康唑(CYP3A抑制剂)和1-氨基苯并三唑(CYP450酶广谱抑制剂)能显著降低TPN729的人肝微粒体代谢,提示体内可能引起药物相互作用。动物实验中,比格犬给予CYP3A抑制剂酮康唑后,TPN729的体内Cmax和AUC0-∞分别增加至2.5和7.8倍;给予CYP3A诱导剂利福平后,Cmax和AUC0-∞分别降低至36.3%和24.9%,表明同时服用CYP3A抑制剂和诱导剂会对TPN729的药动学产生显著影响。大鼠灌胃给予TPN729并联合给予酮康唑或地塞米松(CYP3A诱导剂)获得类似的结果,但采用静脉注射TPN729的给药方式时,酮康唑或地塞米松不会改变TPN729在动物体内的药动学,表明口服TPN729会经历强首过代谢,联合服用CYP3A抑制剂或诱导剂是通过影响TPN729的首过代谢,从而改变其血药浓度。由于TPN729临床采用片剂口服的给药方式,会经历强首过代谢,因此,应格外关注影响CYP3A活性的药物与TPN729之间的药物相互作用。另外,利用CYP450酶探针底物和人肝微粒体孵化体系评价TPN729引发酶抑制的可能性,并通过提前含或不含NADPH孵育(NADPH+/-)来考察是否存在时间依赖性抑制。结果表明,无论是否提前加入NADPH,TPN729对CYP1A2、CYP2B6和CYP2D6的IC50值均大于100μM,未表现出直接抑制或时间依赖性抑制;TPN729对CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4的IC50 NADPH+值为3.3~9.2μM,且IC50 NADPH-/IC50 NADPH+>2,表现出中等抑制和时间依赖性抑制。但考虑人体内的TPN729暴露水平,预计口服临床最高剂量TPN729(100 mg)后血浆中可达到的浓度仍远低于上述IC50值,因此判断临床上TPN729通过抑制CYP450酶而产生药物相互作用的可能性较小。基于转运体的药物相互作用研究中,采用摄取转运体OATP1B1/1B3/2B1、OAT1、OAT3和OCT2转染的HEK293细胞、Caco-2细胞和外排转运体P-gp转染的MDCKII-MDR1细胞和大鼠体内模型考察转运体在TPN729体内处置过程中的作用,并进一步评价其作为转运体底物或抑制剂引发药物相互作用的可能性。摄取转运体方面,TPN729在摄取转运体细胞株上的摄取速率均与Mock相当,表明TPN729不是上述摄取转运体的底物。同时其对摄取转运体表现出弱抑制作用(IC50=17~193μM),由于IC50值远远高于人体内可达到的最高血药浓度,认为体内不会产生与摄取转运体相关的药物相互作用。Caco-2细胞转运实验的结果表明TPN729的渗透性良好,但是高浓度的TPN729能够使B侧→A侧的表观渗透系数和外排比(ER)降低,提示可能对外排转运体产生了抑制。MDCKII-MDR1细胞转运实验的结果表明TPN729是外排转运体P-gp的底物(ER=30.8),但由于其渗透性良好,因此同时给予P-gp选择性抑制剂不会改变TPN729在大鼠体内的药动学。TPN729对外排转运体P-gp表现出了明显抑制(IC50=0.75μM),由于[I]/IC50大于FDA药物相互作用研究指导原则设定的参考值,根据指导原则的推荐,选择地高辛作为P-gp阳性底物,开展体内药物相互作用试验以评价TPN729通过抑制P-gp而产生药物相互作用的可能性。结果发现临床剂量相关的5 mg/kg TPN729能显著升高大鼠体内地高辛的Cmax和AUC0-∞,分别增加至对照组的3.7倍和1.95倍,对t1/2没有影响,表明TPN729通过抑制胃肠道P-gp增加了地高辛在大鼠体内的吸收,对地高辛的消除没有影响。地高辛是常见的治疗心血管疾病的药物,由于地高辛的安全治疗窗窄,在临床使用过程中若联合使用TPN729与地高辛,可能会升高地高辛在体内的血药浓度,尤其是升高Cmax,从而引起不良反应,本实验也提示TPN729与其他P-gp底物在临床上联合使用时可能引发药物-药物相互作用。3.逆转多药耐药研究上述研究已表明TPN729对外排转运体P-gp具有显著的抑制作用,而外排转运体P-gp过表达是肿瘤细胞形成多药耐药的主要原因之一。本实验采用过表达P-gp的人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/T作为体外模型,结合裸鼠体内移植瘤模型,考察TPN729是否能通过抑制肿瘤细胞表面过表达的P-gp,减少肿瘤细胞对抗肿瘤药物的外排,从而恢复肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,起到逆转肿瘤多药耐药的作用。细胞系的选择方面,前期在大鼠体内的组织分布实验结果表明,TPN729在肺组织的浓度较高,浓度约为血浆的100倍。由此根据TPN729在人血浆中的Cmax,预计在人体内肺组织的浓度可达到10 u M,高于体外MDCKII-MDR1细胞系中测得的IC50值。因此,本实验采用过表达P-gp的人肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/T作为体外模型,采用抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素作为P-gp的底物,考察TPN729对多药耐药的逆转作用,并进一步建立A549/T裸鼠移植瘤模型验证TPN729是否能在体内发挥肿瘤多药耐药的逆转作用。结果显示TPN729能够显著降低紫杉醇和阿霉素对A549/T的IC50,恢复肿瘤细胞对这两种P-gp底物的敏感性(逆转倍数分别为22.9与5.35),而不改变耐药细胞株对顺铂(非P-gp底物)的药物敏感性,也不改变抗肿瘤药物对敏感细胞株的IC50,同时TPN729可以增强紫杉醇诱导的耐药细胞凋亡,处于凋亡早期及晚期的细胞比例共增加约30%,这些结果表明TPN729能通过抑制P-gp增强抗肿瘤药物的细胞毒作用,表现出多药耐药逆转作用。机制实验考察了TPN729对抗肿瘤药物在耐药细胞中积累的影响以及TPN729对P-gp蛋白表达的影响。结果显示TPN729(10μM)可以增加耐药细胞内紫杉醇浓度至对照组的4.1倍,升高耐药细胞内的阿霉素浓度为对照组的6.8倍,且TPN729对耐药细胞中抗肿瘤药物积累的增加表现出浓度依赖性。TPN729不会影响P-gp蛋白的表达,通过直接抑制P-gp的功能减少抗肿瘤药物的外排,从而增加抗肿瘤药物在耐药细胞中的积累。建立A549/T裸鼠体内移植瘤模型之后,比较了单独给予紫杉醇和联合给予TPN729和紫杉醇后肿瘤的生长情况。给药14天后,A549/T移植瘤对紫杉醇表现出耐药性,5 mg/kg的紫杉醇抑瘤效果较弱,但同时给予TPN729和紫杉醇可以明显增强紫杉醇的抑瘤效果,显著减缓肿瘤的生长,第14天紫杉醇组和联合给药组的平均肿瘤重量分别为对照组的89%和34%,平均肿瘤体积分别为对照组的83%和37%。体内肿瘤组织的细胞凋亡采用TUNEL法进行检测,实验结果验证了TPN729增强了紫杉醇诱导的耐药肿瘤组织细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长。A549/T裸鼠体内移植瘤实验结果表明TPN729能在体内发挥多药耐药逆转作用,减缓肿瘤生长,未来可以考虑开发TPN729作为新型多药耐药逆转剂。4.结论TPN729在人体内发生广泛代谢,代谢途径包括氧化脱胺、N-去烷基、氧化开环、羟基化、羰基化、N-氧化、脱氢及葡萄糖醛酸结合。口服TPN729后吸收完全,血浆中主要检测到的药物相关物质是N-去四氢吡咯乙基代谢产物M3,而未被代谢的原形药物主要通过肾脏排泄。TPN729是CYP3A4的敏感底物,口服TPN729会经历强首过代谢,联合服用CYP3A抑制剂或诱导剂会影响TPN729的首过代谢,从而改变其血药浓度,影响其安全性和有效性。TPN729对外排转运体P-gp表现出明显抑制,临床剂量相关的TPN729能显著升高大鼠体内地高辛的暴露。TPN729与其他P-gp底物在临床上联合使用时可能引发药物-药物相互作用,安全性值得关注。TPN729能够浓度依赖性地抑制耐药肿瘤细胞表面过表达的P-gp,增加抗肿瘤药物在耐药肿瘤细胞中的积累,从而恢复肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性,起到逆转肿瘤多药耐药的作用,在移植瘤裸鼠体内可有效增加紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡,并显著减缓肿瘤生长,未来可考虑开发其作为P-gp介导的多药耐药的逆转剂。