研究目的细胞色素P450酶3A4(cytochrome P450 3A4,CYP3A4)是人体中重要的药物代谢酶,它能够氧化代谢临床上大约60%的药物。CYP3A4的表达和活性在不同个体间存在非常大的差异且难以预测和评估。既往研究已表明,CYP3A4的表达能被多种临床常用药物诱导和抑制,这是导致CYP3A4表达和活性个体差异的一个重要原因,而且会引起药物相互作用和不良反应的发生,对药物研发和临床安全用药造成了很大的困扰。以往的研究主要集中于遗传因素如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)对CYP3A4表达的影响,然而SNP在人群中的分布频率普遍较低且仅能解释大约10-30%的个体差异。近年来的研究表明,表观遗传修饰能从多个水平上参与药物代谢酶基因的表达调控,如DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化、非编码RNA(non-coding RNA)等。组蛋白修饰是一种重要的表观遗传调控机制,组蛋白甲基化和乙酰化修饰与基因的转录激活与抑制有着密切联系,是细胞生命活动中重要的调节机制。孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是肝脏中重要的核受体,CYP3A4的基因表达受PXR的调控,但其确切的调控机制不十分清楚,是否需要有其他关键因子协同其调控CYP3A4表达?已有研究表明组蛋白甲基化和乙酰化在一些CYPs的基因表达中发挥关键的调控作用,但组蛋白修饰对PXR介导的CYP3A4诱导表达的影响尚未见报道。本研究提出假设:药物激活PXR可通过募集相关的辅激活因子如核受体辅激活因子6(nuclear receptor coactivator 6,NCOA6)和组蛋白乙酰化转移酶p300等,识别CYP3A4基因启动子区PXR的结合位点并引起组蛋白修饰的改变,从而激活CYP3A4的转录。已有研究报道microRNA作为一种特殊的表观遗传学修饰,可以通过直接靶向CYP3A4的3’端非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)而调控其表达,或通过靶向调控转录因子如PXR等间接影响CYP3A4的表达。然而,miRNA在药物诱导CYP3A4表达中的作用及机制尚未见报道。综上,本课题拟从组蛋白甲基化、乙酰化修饰和miRNA调控的角度探讨PXR配体利福平诱导CYP3A4基因表达调控的表观遗传机制,主要从以下几个方面展开研究:(1)组蛋白修饰在利福平诱导CYP3A4表达中的作用及机制;(2)miRNA在利福平诱导CYP3A4表达中的作用及机制;(3)人肝脏组织中miRNA表达和组蛋白修饰与CYP3A4基础表达个体差异的关系。该研究为阐明药物代谢酶个体差异的分子机制提供理论依据,以期有助于新药研发和指导临床合理用药。材料与方法1.人肝脏组织标本的收集本研究所用肝脏组织样本从郑州大学第一附属医院收集,标本来源为肝血管瘤、胆囊癌、肝胆管结石等患者进行肝部分切除术所获得的正常肝脏组织。所有样本已排除肝炎及其他传染性疾病,且患者肝、肾功能正常。研究方案经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会的批准,所有标本的收集均获得患者的同意并在手术前签署了知情同意书。样本保存于液氮中直至实验。2.CYP3A4在肝细胞中的诱导表达和人肝脏组织中表达的测定本研究经过筛选后使用LS174T和HepaRG两种细胞系作为利福平诱导CYP3A4表达的模型进行实验。用利福平(10μM)诱导LS174T细胞和HepaRG细胞后,以Trizol法提取总RNA并采用一步法反转录合成cDNA,采用Reai-time quantitative PCR(qPCR)和Western Blot检测CYP3A4诱导表达水平,并检测CYP3A4在人肝脏组织中的mRNA和蛋白基础表达水平。3.RNA干扰实验分别构建特异性靶向目标基因PXR、NCOA6和p300的shRNA表达载体,瞬时转染细胞后通过嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株。检测PXR、NCOA6和p300表达的下调作用并分析对利福平诱导效应的影响以及对组蛋白修饰的影响。4.染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)分析CYP3A4基因启动子区组蛋白修饰水平将利福平诱导后的细胞用1%甲醛溶液交联后进行超声破碎剪切DNA片段,分别使用相应的抗体进行免疫共沉淀,用qPCR分析利福平对CYP3A4基因启动子区PXR结合区域H3K4三甲基化(H3K4me3)、H3K27三甲基化(H3K27me3)和H3乙酰化(H3ac)水平以及对PXR、NCOA6和p300结合的影响。5.细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测蛋白质在细胞中的定位及相互作用制备LS174T细胞爬片并给予利福平(10μM)诱导48 h,根据细胞免疫荧光步骤操作并使用激光共聚焦显微镜观察PXR、NCOA6、p300蛋白在细胞中的分布及共定位状态。收集利福平诱导后的LS174T细胞并提取总蛋白,用NCOA6或p300的抗体进行Co-IP实验,分析PXR和NCOA6/p300之间的蛋白质相互作用。6.利福平对HepaRG细胞中miRNA表达的影响使用mirVanaTM miRNA提取试剂盒提取HepaRG细胞总RNA,通过Human miRNA array V4.0表达谱芯片(Affymetrix)检测miRNA的表达。使用生物信息学预测筛选能够靶向CYP3A4的差异表达miRNA,并通过qPCR分析验证利福平对miRNA表达的影响。构建携带CYP3A4 3’-UTR全长的荧光素酶报告基因载体并对miRNA可能的结合位点进行定点突变,通过报告基因筛选并明确调控CYP3A4的miRNA。7.人肝脏组织中miRNA表达和组蛋白修饰水平的检测通过Real-time qPCR检测所收集的人肝脏组织中miRNA的表达,ChIP-qPCR分析部分组织样本CYP3A4基因启动子区组蛋白修饰水平,并与CYP3A4的表达进行关联分析。统计学处理数据以均值±标准差表示,两组之间的均数比较采用t检验,多组之间均值的比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni’s post hoc test或Dunnett’s test进行分析,关联分析采用spearman相关性分析,数据的统计分析使用SPSS软件进行。以P值小于0.05认为差异有统计学意义。实验结果(一)组蛋白修饰在利福平诱导CYP3A4表达中的作用及机制1.利福平对LS174T细胞中CYP3A4表达的诱导作用与对照组(0.1%v/v,DMSO)比,利福平(10μM)能够上调LS174T细胞中CYP3A4的mRNA(4~15倍,P<0.05)和蛋白(1.6~2.9倍,P<0.05)的表达且呈时间依赖性,而通过shRNA干扰PXR的表达后则显著降低利福平对CYP3A4的诱导作用(下调70%,P<0.05),该结果提示利福平诱导CYP3A4的表达与PXR有关。2.利福平对CYP3A4基因启动子区组蛋白修饰水平及PXR、NCOA6和p300结合状态的影响通过ChIP-qPCR分析发现,利福平诱导LS174T细胞中CYP3A4表达的同时改变了CYP3A4基因启动子区的组蛋白修饰状态。与对照组(0.1%v/v,DMSO)比,利福平(10μM)使CYP3A4启动子序列上PXR结合区域的组蛋白H3K4me3和H3乙酰化水平显著升高(P<0.05)而使H3K27me3水平显著降低(P<0.05),这种改变与CYP3A4表达的上调相一致。结果提示,组蛋白甲基化和乙酰化水平的改变与CYP3A4的诱导表达有关。进一步分析PXR、NCOA6和p300在CYP3A4基因启动子PXR结合区域的富集水平发现,利福平能够显著提高PXR结合区域NCOA6和p300的结合(上调>1.5倍,P<0.05),这进一步提示组蛋白甲基化和乙酰化状态的变化参与了利福平对CYP3A4的诱导作用。3.干扰NCOA6和p300的表达对利福平诱导CYP3A4表达及组蛋白修饰状态的影响通过RNA干扰实验将LS174T细胞中NCOA6和p300的表达抑制,发现CYP3A4 mRNA的基础表达显著的下调(分别下调65%、31%,P<0.05),而利统计学处理福平对CYP3A4的诱导作用也被显著下调(下调>70%,P<0.05)。将NCOA6和p300的表达抑制后,CYP3A4启动子PXR结合区域的H3K4me3和H3乙酰化水平显著降低(P<0.05)而H3K27me3则明显升高(P<0.05),同时利福平对CYP3A4启动子区H3K4me3、H3K27me3和H3乙酰化水平的改变也被明显抑制。这表明,利福平对CYP3A4的诱导作用以及组蛋白修饰状态依赖于NCOA6和p300的作用。4.利福平通过激活PXR而改变CYP3A4启动子区的组蛋白修饰及NCOA6和p300的结合状态通过RNA干扰实验抑制PXR的表达后,利福平对CYP3A4启动子区H3K4me3、H3K27me3和H3乙酰化水平的影响被明显抑制,H3K4me3和H3乙酰化水平较对照组明显下降(p<0.05),而H3K27me3水平则显著升高(P<0.05)。此外,NCOA6和p300在CYP3A4启动子区的富集也被明显抑制(下调>50%,P<0.05)。这些结果提示,PXR在利福平引起CYP3A4启动子区组蛋白修饰状态变化中发挥关键作用。进一步通过Co-IP分析发现,PXR能够与NCOA6和p300发生蛋白质相互作用,且利福平能够促进这种相互作用。细胞免疫荧光结果显示,利福平促进PXR、NCOA6和p300在细胞核内的分布,PXR在细胞核内与NCOA6、p300的共定位明显高于对照组。以上结果提示,利福平通过激活PXR并募集NCOA6和p300在CYP3A4基因启动子区的结合从而促进CYP3A4的转录。(二)miRNA在利福平诱导CYP3A4表达中的作用及机制1.利福平诱导CYP3A4表达对miRNA表达谱的影响利福平(10μM)能够使HepaRG细胞中CYP3A4 mRNA的表达上调30倍(vs DMSO对照组,P<0.05),并且改变了65个miRNA的表达(>2倍),其中47个miRNA的表达被下调,18个miRNA的表达被上调。2.生物信息学预测分析miRNA的靶基因生物信息学预测出9个miRNA能够直接靶向CYP3A4的3’-UTR,进一步通过qPCR检测其表达水平,结果显示其中7个miRNA的表达被利福平显著下调:miR-641、miR-628-3p、miR-342-5p、miR-2392、miR-4289、miR-4461、miR-766-5p(>2倍,P<0.05)。这提示,miRNA表达的下调可能与利福平诱导CYP3A4的表达有关。3.miRNA对CYP3A4报告基因荧光素酶活性的影响通过荧光素酶报告基因实验发现miR-628-3p和miR-641能显著降低CYP3A4 3’-UTR报告基因的荧光素酶活性(分别下调50%和48%,P<0.05),而miR-766-5p和miR-342-5p则不影响其活性(P>0.05)。将CYP3A4的3’-UTR相应的结合位点突变后,miR-641和miR-628-3p对荧光素酶活性的下调作用被明显抑制。这提示,miR-628-3p和miR-641通过靶向结合CYP3A4的3’-UTR而发挥对CYP3A4表达的下调作用。4.过表达miR-628-3p和miR-641对CYP3A4的基础和诱导表达的影响在HepaRG细胞中转染miR-628-3p、miR-641的mimics后,CYP3A4的mRNA表达受到明显的下调(分别为38%和55%,P<0.05),且利福平对CYP3A4的诱导效应也被明显降低(分别为27%和35%,P<0.05)。这些结果表明,miR-628-3p和miR-641能够下调CYP3A4的基础表达和利福平的诱导表达。(三)人肝脏组织中组蛋白修饰和miRNA表达与CYP3A4基础表达的相关性1.人肝脏样本中CYP3A4 mRNA和蛋白的表达水平CYP3A4的mRNA和蛋白表达存在显著的个体差异,mRNA的表达水平(相对于GAPDH基因mRNA表达)为0.06~2.59(中位数0.72),最大差异43倍;蛋白的表达水平(相对于GAPDH蛋白表达)为0.10~2.33(中位数0.49),最大差异23倍,而CYP3A4基因mRNA和蛋白表达水平的相关系数为r=0.16,相关性无统计学意义(P>0.05,n=18)。2.肝脏中H3K4me3、H3K27me3和H3ac水平与CYP3A4 mRNA表达的相关性CYP3A4基因启动子区H3K4me3、H3K27me3和H3ac水平在10例肝脏组织样本中也存在显著的个体差异。相关性分析结果表明,CYP3A4的mRNA表达与近端PXR结合区域(-263~-108 bp)H3K4me3水平呈正相关(r=0.574,P<0.05,n=10),而与远端(-8015~-7793 bp)H3K4me3水平有正相关趋势(r=0.597,P=0.068,n=10);远端PXR结合区域(-8015~-7793 bp)的H3K27me3水平与CYP3A4的mRNA表达负相关(r=-0.638,P<0.05,n=10);H3ac水平与CYP3A4的mRNA表达的相关性无统计学意义(P>0.05,n=10)。该结果表明,H3K4me3和H3K27me3修饰与CYP3A4的转录水平有关。3.肝脏中miR-641和miR-628-3p的表达与CYP3A4表达的相关性miR-641和miR-628-3p在肝脏组织中的表达与CYP3A4表达均有相关性。其中,miR-641的表达与CYP3A4的蛋白表达负相关(r=-0.525,P<0.05,n=18);而miR-628-3p的表达与CYP3A4的mRNA表达负相关(r=-0.502,P<0.05,n=10)。该结果表明,miR-641和miR-628-3p与CYP3A4的转录后调控有关。结论1.利福平诱导CYP3A4的表达与其基因启动子区的组蛋白修饰状态有关,通过激活核受体PXR并进一步募集辅激活因子NCOA6和p300而调控CYP3A4基因启动子区的组蛋白修饰水平,从而诱导CYP3A4的表达。2.利福平通过抑制HepaRG细胞中miR-628-3p和miR-641的表达而上调CYP3A4表达。3.人肝脏中CYP3A4的mRNA表达水平与其基因启动子区的H3K4me3和H3K27me3修饰水平显著相关。miR-641和miR-628-3p在肝脏中的表达水平与CYP3A4的表达负相关。