论文部分内容阅读
原产于贵州喀斯特地区的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)具有极强的抗旱性。水通道蛋白在介导植物体水分的运输、维持水分平衡和应对各种逆境胁迫中起着重要的作用。为了探究喀斯特地区野生葡萄质膜水通道蛋白基因的结构特征,及其在干旱胁迫中的作用,以极抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’为试材,不抗旱欧亚种葡萄(V.vinifera)‘红地球’为对照,应用RT-PCR和RACE技术克隆毛葡萄PIP类水通道蛋白基因的cDNA全长序列,并就基因的结构特征、组织表达模式、PEG模拟干旱胁迫对其表达的影响进行分析,并结合水分相关生理指标探究其抗旱机理,构建基因表达载体,对其进行功能验证。主要取得以下研究结果:1.利用RT-PCR和RACE技术克隆并获得9个野生毛葡萄质膜水通道蛋白基因(Vh PIP)的全长cDNA序列。9个PIP基因的全长分别为:1 087、1 063、1 089、970、867、1 054、1 111、1 156、860 bp,分别包含858、861、864、861、858、852、840、864、855 bp的完整开放阅读框。分别命名为:Vh PIP1;1、Vh PIP1;2、Vh PIP1;3、Vh PIP1;4、Vh PIP1;5、Vh PIP2;1、Vh PIP2;2、Vh PIP2;3、Vh PIP2;4,Gene Bank登录号分别为:KM026528、KP164979、KP164980、KP729192、KP765449、KP164981、KP164982、KP729193和KP729194。2.经生物信息学分析,9个VhPIPs氨基酸序列均具有MIP家族信号序列SGGHINPAVT以及植物质膜水通道蛋白(PIPs)的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,分别编码286、286、287、286、285、283、279、287、284个氨基酸,相对分子质量在29.6 k D~30.7 kD之间,理论等电点(pI)在7.7~8.9之间,不稳定系数在26.14~34.06之间,均为稳定性蛋白。VhPIPs蛋白的亲水平均数均在0.367~0.569之间,为亲水性蛋白,且无信号肽。对拟南芥、野生毛葡萄、欧洲葡萄和冬葡萄×沙地葡萄杂交种的35个PIPs类氨基酸序列进行同源序列比对,结果表明这些氨基酸的功能区域高度保守,同源性在77.8%以上。对这35个PIPs氨基酸序列进行聚类分析表明,35个PIPs被分为两类,PIP1s占据一个分支,PIP2s占据另一个分支。3.利用荧光定量PCR技术对9个PIP基因的组织表达模式进行分析,结果表明9个PIP基因在葡萄的根、茎和叶中均有表达,其中抗旱性极强的‘花溪-9’中的Vh PIP1;1、Vh PIP1;2、Vh PIP1;4、Vh PIP2;1、Vh PIP2;2和Vh PIP2;4在地下部的表达量最多,Vh PIP1;5和Vh PIP2;3在叶中的表达量最多,Vh PIP1;3在根、茎和叶中的表达量无显著性差异。而在抗旱性不强的欧亚种‘红地球’中Vv PIP1;1、Vv PIP1;4和Vv PIP2;3在根中的表达量较高,Vv PIP1;2、Vv PIP1;3、Vv PIP1;5和Vv PIP2;4在地上部的表达量较高,Vv PIP2;1和Vv PIP2;2在其根、茎和叶中的表达量无显著性差异。4.对9个PIP基因的干旱胁迫表达模式进行分析,结果发现不同的PIP基因在不同葡萄品种(单株)的不同组织中的表达模式有一定的差异。在不同品种(单株)的不同组织中,这9个PIP基因的干旱表达模式主要分为3种:表达量没有发生显著性变化,即‘花溪-9’和‘红地球’根、茎和叶中的PIP1;2、PIP1;4、PIP1;5和PIP2;3,‘红地球’根中的Vv PIP1;3;表达量呈先上升后下降的变化趋势,即‘花溪-9’根中的Vh PIP1;1、Vh PIP2;1、Vh PIP2;2和Vh PIP2;4,茎中的Vh PIP1;1、Vh PIP2;1和Vh PIP2;2,叶中Vh PIP2;2,‘红地球’根、茎和叶中的Vv PIP1;1、Vv PIP2;1和Vv PIP2;2,叶中的Vv PIP2;4;表达量呈下降趋势,即‘花溪-9’根、茎和叶中的Vh PIP1;3,茎和叶的Vh PIP2;4,叶中Vh PIP2;1,‘红地球’茎中的Vv PIP1;3和Vv PIP2;4,叶中的Vv PIP1;3。综上,PIP1;1、PIP1;3、PIP2;1、PIP2;2、PIP2;4表达量的变化有显著性差异。5.气孔导度、蒸腾速率、叶片水势、叶片相对含水量和根、茎和叶的质膜相对透性在不同抗旱性的葡萄单株(品种)中的变化有显著性差异。在干旱胁迫下,气孔导度、蒸腾速率、叶水势和叶片相对含水量随着时间的延长逐渐降低,根、茎和叶的质膜相对透性逐渐增大,细胞膜的稳定性逐渐降低。将PIP1;1、PIP1;3、PIP2;1、PIP2;2、PIP2;4在干旱胁迫下的表达模式与各水分相关生理指标进行相关性分析。结果表明,气孔导度、蒸腾速率、叶片水势和叶片相对含水量与基因的表达量呈正相关,质膜透性与基因的表达量呈负相关。且Vh PIP2;1、Vh PIP2;2、Vh PIP2;4与‘花溪-9’的各水分生理指标相关性较大,结合最大相关系数(r2)可知,Vh PIP2;1与各水分相关指标的关系最大,选择其进行功能验证。6.成功构建了植物表达载体pBI121-35S-VhPIP2;1,利用农杆菌介导与花絮浸渍法相结合将Vh PIP2;1成功导入拟南芥。对T4代转基因植株进行PEG-6000模拟干旱胁迫处理,检测转基因植株对干旱胁迫的耐性。结果表明转Vh PIP2;1基因的植株对干旱胁迫的耐性均高于野生型植株,转基因植株的幼苗成活率、幼苗的根长和地上部水势显著高于野生型植株,分别是未转基因植株的1.5、1.3和1.4倍,推断Vh PIP2;1通过影响植物细胞水势的调节而影响植物的胁迫耐性。