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目的:
检测人类白细胞抗原-G(HLA-G)在胃癌组织及细胞系中的表达,初步探讨其在胃癌免疫逃逸中的作用机理及临床意义,并评估其在胃癌诊断和预后中的价值。
方法:
1.应用免疫组织化学SP法检测HLA-G及Tregs在179例胃癌组织及相应癌旁正常胃组织中的分布及表达情况,探讨其与胃癌临床病理特点及复发预后的关系。
2.应用Western Blot法检测HLA-G在30例胃癌组织及相应癌旁正常胃组织中的表达,证实HLA-G的表达在癌组织与正常组织间存在差异。
3.应用RT-PCR、Real-time PCR和Flow Cytometry检测胃癌细胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HGC-27中HLA-G的表达。
4.应用脂质体2000将pVITR02-mcs vector-HLA-G及对照空载体pVITRO2-mcsvector分别转染到细胞系SGC-7901内,利用潮霉素B进行稳筛后分别称为SGC-7901-G和SGC-7901-V细胞系。然后利用Real-time PCR和western blot检测转染前后HLA-G的表达。并与健康人PBMC进行共培养,检测培养体系中CD3+CD25+FoxP3+T细胞的变化,同时应用酶标记免疫吸附测定法(ELISA)检测共培养体系中IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ和TNF-α的表达水平。探讨HLA-G在胃癌免疫逃逸中可能的作用机理。
5.应用ELISA法对82例胃癌、52例浅表性胃炎、36例萎缩性胃炎、39例胃上皮内瘤变及67例健康体检者血浆标本进行检测,比较不同组间sHLA-G表达水平的差异及其与胃癌临床病理特点间的关系,同时应用电化学发光法检测CEA的表达水平。运用ROC曲线评估sHLA-G及CEA在胃癌早期诊断中的价值,将二者进行比较,探讨sHLA-G在胃癌早期诊断及临床应用中的价值。
结果:
1.免疫组化染色结果显示,胃癌组织中HLA-G的阳性表达率达49.7％(89/179),而癌旁正常胃组织中无表达(0/179),二者相比较有显著的统计学差异(P＜0.05)。HLA-G的阳性表达与胃癌的浸润深度、邻近脏器受侵及临床分期显著相关(P＜0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小、Borrmann分期、淋巴结转移、分化程度及淋巴结转移无统计学差异(P＞0.05)。HLA-G阳性患者的5年总体生存率、肿瘤相关生存率及无病生存率均显著低于HLA-G阴性表达者(P＜0.05)。Cox回归多因素分析的结果显示HLA-G阳性表达是独立的预后因素。肿瘤中Tregs的浸润与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处脏器侵犯以及临床分期相关(P＜0.05),而与年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、Borrmann分期(P＞0.05)无统计学差异。Tregs高浸润胃癌患者的5年总体生存率、肿瘤相关生存率及无病生存率均显著低于低Tregs浸润胃癌患者(P＜0.05)。Cox回归多因素分析结果显示高Tregs浸润是独立的预后因素,且HLA-G的表达和Tregs的浸润呈显著相关。
2.Western Blot结果显示HLA-G在胃癌组织中出现阳性条带,约39kDa大小,而对照组(癌旁正常组织)中均无条带出现,进一步证实HLA-G在胃癌组织中表达而在正常胃组织中不表达。
3.HLA-G mRNA及蛋白在胃癌细胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HG-C-27中均低表达;SGC-7901转染HLA-G(SGC-7901-G)并稳筛后,经检测HLA-G mRNA及蛋白的表达水平均显著升高。
4.健康人PBMC与SGC-7901-G细胞系共培养,与SG-C-7901-V共培养相比,共培养体系中CD3+CD25+FoxP3+T细胞显著上调,同时,SGC-7901-G共培养体系上清中IL-6和IL-10显著上调,TNF-α显著下调。
5.胃癌组血浆中sHLA-G(138.76U/ml)表达水平均显著高于胃上皮内瘤变组(57.28U/ml)、萎缩性胃炎组(55.55U/ml)、浅表性胃炎组(46.03U/m)及健康对照组(39.28U/ml)(P＜0.001);胃上皮内瘤变组血浆sHLA-G水平显著高于健康对照组(P＜0.05);而胃上皮内瘤变与浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组之间,浅表性胃炎组与萎缩性胃炎组之间以及浅表性胃炎组、萎缩性胃炎组与健康对照组之间差异均无统计学意义(P＞0.05)。胃癌组血浆CEA水平显著高于其他各组(P＜0.01)。并且胃癌患者血浆sHLA-G水平与患者年龄及肿瘤大小显著相关(P＜0.05),而与患者性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期均无统计学差异(P＞0.05)。sHLA-G诊断的ROC曲线AUC为0.814,显著高于CEA的ROC曲线AUC0.692(P=0.01)。sHLA-G和CEA联合检测诊断的ROC曲线AUC为0.846,显著高于sHIA-G或CEA(P＜0.001)。提示sHLA-G的诊断价值要比CEA优越,两者联合诊断优于单独诊断,结果具有更高的敏感性和特异性,从而进一步证实sHLA-G单独或者与其他传统标志物联合应用有助于胃癌的早期诊断。
结论:
1.HLA-G在胃癌组织中的阳性表达显著高于癌旁正常胃组织,HLA-G的阳性表达与胃癌患者的总体生存率、肿瘤相关生存率和无病生存率显著相关,是影响预后的独立因素,提示其在胃癌的发生、发展中发挥着重要的作用。
2.肿瘤组织中Tregs的浸润显著高于正常组织,HLA-G阴性患者呈现Tregs低浸润,相反,HLA-G阳性表达的患者呈现Tregs高浸润,两者呈显著阳性相关。同时,Tregs浸润与胃癌病变浸润程度、淋巴结转移、远处器官侵犯以及临床分期呈明显相关。Tregs高浸润患者的5年总体生存率、肿瘤相关生存率及无病生存率显著低于Tregs低浸润者。
3.HLA-G过表达的胃癌细胞系SGC-7901与健康人PBMC共培养后,CD3+CD25+FoxP3+T细胞显著上调且影响Th1/Th2因子的表达,提示HLA-G通过影响Tregs和Th1/Th2平衡来导致机体免疫功能低下,从而有利于肿瘤细胞生长及侵袭,为阐明HLA-G在胃癌发生发展中的具体作用机制提供了新的线索。
4.通过与胃癌肿瘤标志物CEA的相互比较和联合应用,提示sHLA-G在胃癌早期诊断中有一定的优势,具有潜在的临床应用价值。