[研究背景与目的]原发性肝癌(primay hepatic cancer,PHC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,每年至少有50万新发病例。包括中国东南,台湾,香港,韩国,泰国,新加坡,马来西亚的东南亚地区和热带非洲国家是全球发病率最高的地区,年发病率﹥10-20 /10万,且发病率呈上升趋势。大多数肝癌合并有肝硬化,主要的致病因素有病毒性肝炎,酗酒及黄曲霉素的摄入。肝癌患者预后较差,未经治疗的肝癌患者的自然生存时间仅为8.4个月。肝切除术是治疗肝癌的有效方法,然而只有10-20%的肝癌在诊断时具有可切除性。肝移植切除了全部病肝、局部淋巴结和可能侵犯的邻近血管,既根治性切除了肝癌,消灭肿瘤生长的“土壤”,降低肝癌复发率,又解决了同时合并的门静脉高压症问题,恢复了肝脏的正常结构与功能,理论上具有无可比拟的优势,相对于肝癌的常规治疗方法具有更加光明的应用前景。然而由于供体的短缺、同时大部分患者无法独立承担进行肝移植的巨额医疗费用,使得肝移植治疗肝癌受到极大的制约。而且患者行根治性治疗后复发率较高。化疗为肿瘤综合治疗的重要手段之一,然而,肝癌对目前绝大多数化疗药物不敏感或易产生耐药性,因此,迫切需要发展新的化疗药物。过氧化物酶体增长因子活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)属于核激素受体超家族,目前已鉴别出三种PPAR亚型(PPARa,PPARγ和PPARδ),其中对PPARγ的研究最为广泛。PPARγ与激动剂结合后与维甲酸X受体(RXR receptor)形成异二聚体PPARγ/RXR,后者作为转录调节因子与过氧化物酶体增长因子反应元件(peroxisome proliferator responsive element,PPRE)相互作用,调节目的基因的表达,参与调节脂质代谢与糖代谢、脂肪细胞分化和能量平衡、炎症反应、动脉粥样硬化及肿瘤细胞的分化与凋亡等生理和病理过程。PPARγ激动剂可分为天然激动剂和合成激动剂两大类。前者包括长链多不饱和脂肪酸和二十烷类衍生物,其中15-脱氧前列腺素J2(15-deoxy-Delta(12,14)-PGJ2, 15d-PGJ2)是一个较强的天然PPARγ激动剂,激活浓度大约在微摩尔。后者包括使用最为广泛的糖尿病治疗药物噻唑烷二酮类(thiazolidinedione,TZD),如曲格列酮(troglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)及LY171.833。越来越多的证据表明,绝大多数人类肿瘤表达PPARγ,PPARγ激动剂具有显著的抗肿瘤作用。但确切的分子机制尚未完全阐明。本实验以肝癌细胞株HepG2为研究模型,选择PPARγ激动剂troglitazone,通过体外实验探讨PPARγ激动剂抑制肿瘤增殖的机制。[研究方法]1. MTT法检测HepG2细胞增殖;2.流式细胞仪分析细胞周期;3. TUNEL法检测细胞凋亡;4.免疫细胞化学检测?-catenin和survivin的细胞内定位,活化caspase-3和分化标记物E-cadherin的表达;5.相差倒置显微镜观察细胞形态的改变;6. Western blotting技术检测cyclin D1、c-Myc、survivin、Bax蛋白的表达;7.分化标记物清蛋白和去分化标记物甲胎蛋白(a-fetoprotein ,AFP)分别用溴甲酚绿法和化学发光法检测;8.统计处理方法:应用SPSS软件进行统计处理,数据用均数±标准误表示,采用t检验进行比较。[研究结果]1. MTT检测结果显示:不同浓度(5,10,20,40,80和100μmol/L)troglitazone作用HepG2细胞120 h,细胞存活率分别为96.8%±1.22%、53.4%±1.2%、42.3%±1.2%、31.4%±1%、13.6%±0.8%和9.6%±0.7% ,troglitazone以浓度依赖性方式抑制肝癌细胞增殖。2.低浓度troglitazone具有诱导肝癌细胞分化的作用。2.1细胞周期分析10μmol/L浓度troglitazone处理HepG2细胞120 h后,与对照组比较,G0/G1期细胞比例增加(67.6±0.5% vs.56.3±1.5%, t=12.02,P<0.01),而S期细胞比例减少(20.6±0.5%vs. 25±1.0%,t=6.5,P<0.01),细胞周期明显阻滞于G0/G1期;2.2分化标记物改变10μmol/L浓度troglitazone处理HepG2细胞120 h后,与对照组比较,肝细胞特有的分化标记物清蛋白表达增加[0.53±0.05(g/L) vs.0.3±0.1%(g/L), t=3.5,P=0.025 ) ,而去分化标记物AFP则明显下降[850.3±37.8(ug/L) vs.471.3±61.1(ug/L),t=9.13,P<0.01)。且80%的细胞出现分化标记物E-cadherin的表达。2.3β-catenin亚细胞定位和下游靶基因的改变10μmol/L浓度troglitazone处理HepG2细胞120 h后, ?-catenin亚细胞定位由细胞核转位至细胞质,具有调控细胞增殖和分化作用的?-catenin靶基因cyclin D1、c-Myc蛋白表达下降。3.高浓度troglitazone具有诱导肝癌细胞凋亡的作用。3.1细胞形态改变:人肝癌HepG2细胞生长状况经20μmol/L和30μmol/L troglitazone处理24 h后,倒置显微镜下可见细胞由贴壁脱落,悬浮于培养液中,细胞变圆、变钝,细胞体积变小,伴有核固缩,而对照组则细胞成片生长,饱满舒展,贴壁并少有脱落;3.2流式细胞仪检测发现:troglitazone处理HepG2细胞24 h后可诱导细胞凋亡,凋亡率20μmol/L为25.5±1.1%,30μmol/L troglitazone为43.9±1.7%,而对照组未见细胞凋亡。3.3 TUNEL法检测显示:troglitazone处理HepG2细胞24 h后可引起广泛的凋亡征象,如胞浆减少、体积变小、核固缩、碎裂、荧光显微镜下反光增强等。细胞凋亡率随troglitazone浓度增加而增加。20μmol/L为22.4±1.2%,30μmol/L troglitazone为38.6±0.8%,而对照组未见凋亡征象。3.4细胞免疫化学染色检测活化caspase-3的表达:troglitazone处理HepG2细胞24 h后有活化caspase-3的表达,染色阳性信号为棕黄色颗粒,出现在细胞体积变小,细胞质浓缩的细胞中。20μmol/L troglitazone和30μmol/L troglitazone两组的阳性细胞率分别为21.2±1.4%和35.8±2.4%,而对照组无阳性细胞。3.5细胞免疫化学染色检测凋亡抑制因子survivin的表达:对照组survivin表达主要位于细胞核,20μmol/L troglitazone和30μmol/L troglitazone处理HepG2细胞24 h后,survivin定位由细胞核不完全移位至细胞质,且表达强度明显下降,在处理组同时可见体积变小、细胞质浓缩的凋亡细胞。3.6 Western blotting检测发现:20μmol/L troglitazone和30μmol/L troglitazone处理HepG2细胞24 h后,troglitazone以浓度依赖性方式抑制HepG2细胞survivin的表达,但对促凋亡蛋白Bax蛋白的表达无明显影响[研究结论]1. Troglitazone以浓度依赖性方式抑制肝癌细胞增殖;2.不同浓度的troglitazone抑制肝癌细胞增殖的机制不同;3.低浓度(10μmol/L浓度)troglitazone具有诱导肝癌细胞分化的作用,可能的机制与调控?-catenin信号通路有关;4.高浓度( 20μmol/L和30μmol/L浓度)troglitazone具有诱导肝癌细胞凋亡的作用,可能的机制与调控凋亡抑制因子survivin的细胞定位并抑制其表达,进而活化caspase-3有关。