研究背景世界范围内,创伤已经占世界总死亡原因的10%和总致残原因的16%。近年来,因为院前急救技术不断取得进展,如抗生素的早期规范运用,经历严重创伤的患者普遍能存活下来,但患者入院后往往伴随着并发症,如脓毒症(sepsis)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的发生[1]。现在已经证明,严重创伤患者失调的免疫反应和炎症反应导致了脓毒症和多器官功能障碍综合征的发生,而越早发现和治疗脓毒症和多器官障碍综合征对患者的预后越好[2]。随着研究更加深入,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和机体抗感染免疫反应之间的联系日益清晰[3,4]。这些关联研究的结论不仅能够为治疗感染类疾病提供药物靶点,也使我们对疾病发生发展的生物机制了解更加透彻。Nuclear factor-κB(NFKB)基因家族在创伤病人脓毒症的发生发展中扮演重要角色。人类NFKB家族包括五个成员:p50,p52,p65(RelA),RelB,和c-Rel,分别由NFKB1、NFKB2、RELA、RELB和REL基因编码。NFKB同源或异源二聚体调控一系列基因表达,细胞增殖、分化、凋亡[5,6]。在静息细胞,绝大多数NFKB二聚体结合抑制蛋白以非激活形式存在于细胞质中。许多细胞外刺激因子,包括细菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide,LPS)、病毒、氧化剂、炎性细胞因子和免疫刺激因子能激活NFKB[7,8]。一旦NFKB激活,NFKB二聚体从细胞浆释放,转移到细胞核并协调靶基因如前炎症因子、趋化因子、炎症相关酶和粘附分子的转录[9,10]。NFKB还调控参与固有免疫和获得性免疫反应的基因[11,12]。NFKB家族在sepsis发生发展中的重要作用使得它成为一个关联分析中很有前景的候选基因。尽管一些研究已经发现了NFKB基因家族上的一些单核甘酸多态性位点,但这些位点是否与严重创伤后患者的免疫炎症反应以及脓毒症和多器官功能障碍综合征的发生发展有关还不清楚。本研究的目的是寻找NFKB家族基因上的能代表全基因遗传变异信息的标签SNP位点,探索NFKB家族基因多态性与创伤脓毒症易患性的联系。我们首先挑选出NFKB家族基因的标签单核甘酸多态性位点;其次,将来自和脓毒症关联最密切的nfkb经典通路中的四个标签snp位点在重庆地区创伤人群中进行临床验证,寻找与脓毒症发病和mods评分相关的多态性位点;最后,我们探索了发现的与脓毒症发病相关的标签snp位点的可能存在的功能,观察该多态性位点对细胞因子表达的影响。材料与方法1.挑选nfkb家族标签snp位点。从genbank数据(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中获得nfkb基因家族(nfkb1,nfkb2,rela,relb和rel)全基因和上下游5kb内的基因序列信息;从hapmap数据库(www.hapmap.org)获得nfkb基因家族全基因及其延伸范围在中国北京汉族人群(chinesehanbeijing,chb)中的snp基因型数据。使用软件haploviewversion4.2(broadinstituteofmitandharvard,cambridge,mass)对每个nfkb基因家族成员构建单倍型block,并利用获得各个snp之间的连锁不平衡(linkagedisequilibrium,ld)关系结合关联研究挑选标签snp位点。2.对来自nfkb经典激活通路(包括nfkb1,rela和rel基因)上的标签或潜在功能性snp位点在重庆严重创伤人群中用焦磷酸测序法进行基因分型,探索这些多态性位点与脓毒症和多器官功能障碍综合征的联系。研究人群:我们总共获得连续收集的753例无关联重庆地区汉族严重创伤患者样本,来自重庆大坪医院和重庆急救中心,时间自2005年1月至2014年6月。snp位点基因分型:获得血液样本后,使用试剂盒提取dna,存于-80?c冰箱。使用焦磷酸测序法进行基因分型[20]。根据双盲原则,分型由不知道患者临床特征的人员完成。为了保证分型的准确性,10%的样本进行了重复验证。数据处理:本研究使用了最适宜处理多基因疾病的log-additiveinheritancemodel模型。我们通过计数的方法计算出各等位基因频率。为计算各snp位点基因型在人群中的分布是否满足哈-温平衡(hardy-weinbergequilibrium,hwe),我们选择卡方检验法,p值大于0.05表示基因型分布满足hwe,即在我们研究的创伤人群中各snp位点基因型在遗传过程中保持相对稳定,研究结论在这一群体中有广泛代表意义。我们利用协方差分析计算snp基因型与mods评分之间的关联性。利用软件haploview获得同一基因上各snp之间的连锁不平衡值。我们在显性、隐形和等位基因遗传模式下利用卡方检验计算各标签snp位点基因型与脓毒症发病关联。所有的p值为双边检验,并利用bonferroni校正。p值小于0.05视为有统计学意义。3.体外肿瘤坏死因子-α检测为探索脓毒症和多器官功能障碍综合征易患多态性位点与细胞因子表达的相关性,我们依据majetschak等人方法检测血浆中的细胞因子表达水平。简要步骤是把从创伤患者采集到的全血分为两等分,一管加入lps(100ng/ml),另一管为对照。两者均在在37℃下孵育4小时。之后用elisa试剂盒检测离心后血浆中的肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha,tnf-a)的表达水平并分析其与多态性位点基因型之间的关系。结果1.单倍型的构建和标签snp选择获得的中国北京汉族人群中的snp基因型数据后,通过构建单倍型block图谱从nfkb家族基因中挑选出8个具有代表性和潜在功能性的标签snp(rs28362491,rs3774932,rs4648068,rs7119750,rs4803789,rs12609547,rs1560725andrs842647)。挑选的所有位点在中国北京汉族人群中最小等位基因频率(maf)均大于0.05。2.标签snp在创伤人群中的等位基因频率和基因型分布四个标签snp的分型成功率在98.3%到100%之间。分型结果与数据库中中国北京汉族人群的最小等位基因频率接近。基因型分布满足hardy-weinbergequilibrium(p>0.05)。3.标签snp与sepsis和mods的临床关联在4个进行关联验证的snp(rs28362491,rs4648068,rs7119750andrs842647)中,我们发现来自rel基因的多态性位点rs842647g/a与脓毒症患病风险相关,并且和mods评分相关,其中aa基因型患者较g等位基因携带者有较低的脓毒症发生率,mods评分更低。4.多态性位点rs842647与lps诱导的tnf-α表达水平联系研究发现rs842647位点g等位基因与lps诱导的血浆tnf-α高水平表达相关。结论本研究首次对通过使用标签SNP方法对NFKB1,RELA和REL全基因范围内SNP位点进行临床关联分析。我们发现,多态性位点rs842647G/A与脓毒症患病风险和MODS的严重程度相关并且影响LPS诱导的血浆TNF-α表达水平。这表明多态性位点rs842647可能用于评估脓毒症和MODS的易患风险。