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二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目、螟蛾科,是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一,蛀食水稻茎部,对水稻各个生长发育期均有危害。西花蓟马Frankliniella occidentalis属缨翅目、蓟马科,是世界上最重要的经济作物害虫之一,可通过摄食直接危害蔬菜、水果和观赏作物,也可通过传播番茄斑萎病毒间接产生危害。精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是一种磷酸原激酶,通过MgATP催化精氨酸的可逆磷酸化,形成MgADP和磷酸精氨酸。AK不存在于脊椎动物中并且在昆虫能量代谢和生长发育中具有重要作用,已成为开发高选择性杀虫剂和基于RNAi防治害虫的重要靶标。本文对二化螟CsAK和西花蓟马FoAK基因进行了体外表达和酶学性质分析,研究了CsAK和FoAK的胁迫的响应,系统比较了不同RNA干扰方法对CsAK和FoAK基因的沉默效果,为进一步研究CsAK和FoAK功能以及利用RNA干扰防治二化螟和西花蓟马奠定基础。利用RT-PCR和RACE技术获得了二化螟CsAK基因的全长cDNA序列。CsAK开放阅读框长1068bp,编码355个氨基酸残基。多重序列比对分析发现,CsAK与其他物种AK氨基酸序列一致性均超过73%,其中与棉铃虫HaAK一致性高达98.0%。对CsAK、FoAK和其它代表性昆虫AK的基因组结构分析显示,CsAK与同为鳞翅目的棉铃虫HaAK和家蚕BmAK都只含有1个内含子,FoAK含有4个内含子和5个外显子,而黑腹果蝇DmAK1和DmAK2不含内含子。时空表达模式分析发现,CsAK在预蛹中表达量最低,在羽化12h成虫中表达水平最高,在后肠中表达量显著高于其他组织;FoAK在1日龄预蛹中表达水平最低,成虫期表达水平相对稳定。这些结果表明在昆虫AK的进化过程中发生内含子的频繁丢失或获得,CsAK和FoAK的表达可能受蜕皮激素信号通路调控。分别用42℃高温、4℃低温和百草枯处理二化螟3龄幼虫,发现高温处理后,CsAK mRNA表达水平无显著变化,而在低温处理后,CsAK mRNA表达水平显著上升,处理后4h为对照组的4.65±0.31倍;在用百草枯处理之后,CsAK mRNA表达水平在3h时显著上升,在9h时极显著上升高,分别为对照的2.10±0.09和4.74±0.24倍。分别用39℃高温、-8℃低温和百草枯处理西花蓟马2日龄成虫,发现高温处理后,FoAK mRNA表达水平均显著上升,处理1h后为对照的3.72±0.40倍,低温处理后,FoAK mRNA表达水平在处理1h、2h后无显著变化,在12h显著上升,为对照的1.70±0.12倍;百草枯处理西花蓟马成虫之后,FoAK mRNA表达水平在8h时显著上升,在12h时极显著升高,分别为对照组的3.43±0.25和4.69±0.54倍。这些结果表明CsAK和FoAK可能在二化螟和西花蓟马适应逆境胁迫过程中具有重要作用。通过免疫荧光和Western blotting分析了 CsAK的亚细胞分布,发现CsAK大部分定位于细胞质中,而在细胞核中没有,少部分定位在线粒体中。对异源表达和纯化的CsAK和FoAK的酶学性质分析发现,CsAK的KmArg值为1.27±0.07 mM,Kcat值为18.23±0.34 s-1;FoAK的KmArg值为 1.79±0.05 mM,Kcat 值为 6.74±0.1 2 s-1。底物特异性分析结果显示,CsAK和FoAK对L-精氨酸特异性最高,对L-刀豆氨酸的亲和力分别为L-精氨酸的29.3%和52.4%。分别测定槲皮素和木犀草素对原核表达的CsAK和FoAK的抑制中浓度,发现槲皮素对CsAK和FoAK的抑制中浓度分别为21.5μM和6.74μM;而木犀草素在200μM范围的梯度浓度内均未检测到对AK的抑制作用。这些结果为进一步筛选CsAK和FoAK的抑制剂奠定了基础。比较了不同的RNA干扰方法对CsAK和FoAK的沉默效率。对于CsAK,直接注射dsCsAK 72h后CsAK的干扰效率为47.35%;饲喂合成dsCsAK 24h后CsAK的干扰效率为51.72%;纳米材料包裹dsCsAK点滴处理48h后CsAK的干扰效率为42.65%;ds-dsRNase预处理后饲喂合成dsCsAK 96h后CsAK的干扰效率为54.22%;ds-dsRNase预处理后饲喂表达dsCsAK菌液48h和72h后CsAK的干扰效率分别为64.15%和62.20%;而使用纳米材料包裹dsCsAK饲喂干扰、饲喂表达dsCsAK菌液干扰和ds-dsRNase预处理后注射dsCsAK干扰未取得显著的干扰效率。对于FoAK,饲喂合成dsFoAK 96h后FoAK的干扰效率为45.92%;纳米材料包裹dsFoAK点滴处理24h和48h后FoAK干扰效率分别为29.54%和42.62%;饲喂表达dsFoAK菌液48h后若虫FoAK的干扰效率达到53.83%;72h后成虫FoAK的干扰效率达到79.65%;而纳米材料包裹dsFoAK饲喂处理未取得显著的干扰效率。这些结果表明不同的RNA干扰方法会影响沉默效率。