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研究背景颅内良性胶质瘤是指生长在颅内某一部位(多在脑神经组织外),细胞分化良好,生长缓慢,多能根治的肿瘤。而颅内恶性胶质瘤则相反(大都生长在脑神经组织内),细胞分化不良,生长迅速,难以根治。在美国,每年有近17,000人被诊断为脑肿瘤,其中60%为胶质瘤。根据脑胶质瘤的位置、细胞类型及恶性程度来决定治疗方法。一般采用手术、放疗、化疗联合的方法进行治疗。脊髓瘤能通过手术和放疗联合治疗,而对恶性程度较高的脑胶质瘤进行化疗的效果不理想。在过去十年中,只有BCNU和TMZ(三嗪咪唑的衍生物)这两种化疗药物对恶性胶质瘤的疗效获得了认可。同时,高剂量的BCNU具有内脏毒性,能导致广泛的脊髓抑制。很显然,我们需要新的治疗方法,但是这有赖于技术水平的发展。植物化学物,植物营养因子是指植物中存在的对人体健康有益的化合物,从这些化合物中寻找潜在的应用于癌症治疗的药物已成为新的发展趋势。山竹又名莽吉柿、山竺、山竹子、倒捻子、凤果,原产于马来群岛中的巽他群岛和摩鹿加群岛,有热带果后之称。在东南亚地区山竹的果壳是治疗痢疾、扭伤、伤寒、溃疡,皮肤感染,消炎和杀菌的民间传统用药。关于山竹果壳的化学成分和药理活性,国内报道较少。国外文献报道:山竹果壳具有抗疟原虫、抗氧化、抗肿瘤、保护脑心血管等生物活性。尤其关于α-mangostin(α-倒捻子素)和γ-mangostin(γ-倒捻子素)这两种单体,已有研究表明,α-mangostin对鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的增殖有明显的抑制作用,γ-mangostin对人脑星形胶质母细胞瘤细胞的增殖也有明显的抑制作用,且两者均呈剂量依赖性。α-mangostin促进caspase-3,-8,-9的表达,使Bal-2低表达,Bax高表达,γ-mangostin下调cyclin D1蛋白含量,上调P27蛋白含量。这些变化导致线粒体功能异常,具体表现为线粒体释放细胞色素C至胞浆,诱发凋亡。无论是否有cimetidine(H2R拮抗剂),α-mangostin均浓度依赖性地抑制组胺诱导的兔子主动脉收缩,预示着α-mangostin可能是平滑肌细胞的一种新型竞争性H1R拮抗剂。γ-mangostin抑制5-HT2A受体不抑制1-肾上腺素受体,γ-mangostin是5-HT2A受体显著的选择性和竞争性抑制。孙丽荣讲师的前期研究结果分离提纯了多种山竹果壳中Xanthone类单体,本课题检测其中十七种单体对鼠肾上腺嗜铬细胞瘤和人脑星形胶质母细胞瘤两种细胞增殖的作用,以筛选出更多有效治疗恶性胶质瘤的植物化合物或植物营养成分。研究目的对山竹果壳中Xanthone类单体是否有效抑制鼠肾上腺嗜铬细胞瘤和人脑星形胶质母细胞瘤两种细胞的增殖活性进行初步研究。研究方法1.PC12细胞和U87MG细胞体外培养PC12细胞在含有10%胎牛血清、5%马血清的DMEM培养液中,U87MG细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中,DMEM添加10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素养,均于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。2.MTT检测各单体不同剂量处理后细胞活性的变化。当细胞密度达到80%时传代。传代时弃培养基,加0.25%胰酶消化一分钟,再加入培养基终止消化,轻轻吹落细胞收集至15ml离心管中,900r/min离心3分钟。弃上清,加培养基重悬细胞,并种入96孔板内,100μl/孔,置于细胞培养箱20-24h后加入不同浓度的Xanthone类单体。Xanthone类单体母液均用DMSO溶解,DMSO的终浓度为1/1000。加药物后,置于细胞培养箱培养48h再加入MTT液20μl/孔(终浓度800μg/ml),继续培养4h后去培养基,每孔加入150μlDMSO。空白对照组为无细胞加DMSO 150μ1。室温下,将培养板在摇床上振荡10min,使结晶物溶解,用酶标仪检测光密度(OD值)。3.FCM法测定细胞凋亡率将PC12细胞接种于小皿中,待细胞贴壁生长至85%后,吸尽上清液,加药处理。对照组给予培养液,处理组给予含40μg/mlγ-mangostin(γ-倒捻子素)的培养液;分别培养48 h后收集细胞,加入5μlAnnexin-FITC和5μlPI,避光室温反应10 m in,然后上流式细胞仪,检测细胞凋亡率。研究结果1..MTT法检测PC12细胞和U87MG细胞的增殖活性MTT法检测PC12细胞和U87MG细胞经不同单体处理后的增殖活性的改变。对 PC12 细胞,α-mangostin、γ-mangostin、ep、Ⅰ-1-2、Ⅰ-1-5、Ⅰ-2-1、Ⅰ-2-3、Ⅰ-2-X、Ⅰ-3-3、Ⅱ-1-2、Ⅱ-1-5、Ⅳ十二种提取物经单因素方差分析结果显示,不同浓度梯度对增殖活性的改变具有显著性意义。对U87细胞,α-mangostin、γ-mangostin、ep、Ⅰ-1-2、Ⅰ-1-5、Ⅰ-2-1、1-2-3、Ⅱ-2-X、Ⅰ-3-1、Ⅰ-3-3、Ⅱ-1-2、Ⅱ-1-4、Ⅱ-1-5、Ⅱ-1-6、hu十五种提取物经单因素方差分析结果显示,不同浓度梯度对增殖活性的改变具有显著性意义。2.FCM法测定PC12细胞凋亡率FCM法检测40μg/ml γ-mangostin(γ-倒捻子素)作用于PC12细胞48 h后的流式凋亡图见图2,经两独立样本t检验,经40μg/mlγ-倒捻子素处理48h后,凋亡率明显较对照组增高,且该差异有统计学意义。结论通过MTT检测,山竹果壳中十七种Xanthone类单体,除了目前报道较多的α-mangostin、y-mangostin对PC12细胞和U87MG细胞的增殖活性有明显抑制作用,筛出多种有效作用的单体,且确定其有效作用浓度。为进一步研究其药理活性及作用机制打下基础。