论文部分内容阅读
近十年来,约有15%的夫妇不育,其中男性不育约占50%。主要原因是男性精子发育障碍,主要表现为,弱精、少精和无精子等症状。当前,有大量的与精子发育或凋亡相关基因已经被克隆,但仍然有许多参与生精过程的基因未被鉴定。因此,发现和克隆新的睾丸精子发育相关基因并研究其功能,对解决男性不育具有重要的生理意义。本课题采用分子生物技术和生物信息学相结合的方法,克隆了一个睾丸特异表达新基因C17orf64,并对该基因的时空表达谱和生物学功能进行了初步研究。主要实验结果如下:1.克隆了新基因C17orf64,并对其进行了全面的生物信息学分析。结果表明:小鼠C17orf64的c DNA全长为975bp,位于11号染色体q C-q D区带上的85.14M-85.18M,含有5个外显子,编码由236个氨基酸组成的分子量为27.12 k D的蛋白质。2.C17orf64基因是一个睾丸组织特异表达基因,且与精子的形成密切相关。多组织RTPCR和荧光定量PCR结果显示:C17orf64基因在正常小鼠睾丸组织中高表达,而在其他组织中未检测到表达。该结果被Western bloting进一步证实。RT-PCR和Western bloting结果表明该基因以及编码的蛋白在出生后2周内的睾丸组织中不表达,而在第3周到第6周表达逐步上升,第7,8周保持稳定表达,表明该基因的表达与精子的形成密切相关。免疫组化表明C17orf64蛋白在小鼠的精母细胞,精子细胞中表达,但是其它细胞中不表达,说明该基因的表达具有细胞特异性。亚细胞定位结果显示:p EGFP-C3/C17orf64质粒转染GC-1细胞后,绿色荧光出现在胞核和胞浆,表明C17orf64蛋白主要在胞核和胞浆中表达。3.C17orf64基因能够促进细胞凋亡,抑制细胞的增值。通过流式细胞仪对过表达和干扰C17orf64基因后对GC-1细胞、MCF-7细胞的增殖和凋亡的影响分析。结果显示:过表达C17orf64基因对2种细胞的凋亡有明显的抑制作用。细胞周期分析表明C17orf64基因过表达后,MCF-7细胞被阻滞在G0/G1期。通过western blot实验和q RT-PCR分析了C17orf64基因参与的可能细胞凋亡通路,结果显示:C17orf64基因过表达导致细胞凋亡相关蛋白caspase 9和caspase 3显著升高,提示C17orf64基因可能通过线粒体凋亡途径促进MCF-7细胞凋亡。以上实验结果表明C17orf64基因与精子发生及生精细胞凋亡有关,可能在生精细胞凋亡中起重要作用。